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        滑子菇多糖提取工藝優(yōu)化

        2018-02-28 02:11:34朱振元韓丹
        食品研究與開發(fā) 2018年4期
        關(guān)鍵詞:食用菌多糖活性

        朱振元,韓丹

        (食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津300457)

        食用菌是指子實(shí)體碩大、可供食用的大型真菌,通稱為蘑菇,多屬擔(dān)子菌亞門[1]。食用菌營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常豐富,含有大量的蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、纖維素、維生素、礦物質(zhì)等[2]。食用菌多糖具有抗氧化[3-5]、調(diào)節(jié)免疫力[6-8]、抗腫瘤[9-10]、降血糖[11-12]、抑菌[13]等多種功效。研究報(bào)道表明,食用菌多糖現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于免疫缺陷性疾病和腫瘤等疾病的臨床輔助治療,被稱為一種重要的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑[14]。

        滑子菇,又名珍珠菇、滑菇、真姬菇,因其表面附有一層黏液而得名,是集食用和藥用一體的菌類植物[15]。多糖是滑子菇重要的活性成分之一,具有抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力等生物活性。目前常用的提取方法有:熱水提取法、稀堿水溶液提取法和酶解法[16],多糖是極性大分子,通??捎盟鋈軇﹣硖崛?,因?yàn)榇蟛糠只钚远嗵窃诘蜆O性的有機(jī)溶劑中的溶解度較低,所以可用乙醇或丙酮沉淀粗提液中的活性多糖。為節(jié)省有機(jī)溶劑,對(duì)多糖提取液可先濃縮后沉淀。沉淀物再水洗、過濾或用離心機(jī)除去不溶物。因?yàn)椴僮鞣奖?,成本較低,所以該法是提取水溶性多糖最普遍的方法[17]。食用菌多糖的提取常常受提取時(shí)間、溫度、加水量等因素的影響,從而影響多糖的提取得率[18]。本文采用熱水浸提法提取多糖,通過單因素試驗(yàn)考察提取溫度、提取時(shí)間以及料液比對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)對(duì)多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化從而確定滑子菇多糖的最佳提取條件。

        1 材料與方法

        1.1 原料

        新鮮滑子菇:天津市濱海新區(qū)金元寶農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),經(jīng)烘干、粉粹后過60目篩得滑子菇干粉,用密封袋包好置于干燥器內(nèi)。

        1.2 主要設(shè)備

        粉碎機(jī):天津市康達(dá)電器有限公司;ESJ205-4型電子天平:沈陽龍騰電子稱量?jī)x器有限公司;TGL-16B臺(tái)式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;SP-2102UV型紫外可見分光光度計(jì):上海光譜儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;循環(huán)水真空泵:鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;真空干燥箱:上海益恒科技有限公司;DF-Ⅲ集熱式磁力加熱攪拌水浴鍋:天津歐諾儀器儀表有限公司;ModeL 680酶標(biāo)儀:Thermo ELectron U.S.A;XW-80A微型旋渦混合儀:上海滬西分析儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 滑子菇粗多糖提取工藝

        1.3.1.1 滑子菇粉末的制備

        取定量的新鮮滑子菇在95%乙醇中在室溫下浸泡24 h,以除去其大部分脂質(zhì)。然后,將滑子菇烘干,用粉碎機(jī)粉碎,后過60目篩得滑子菇干粉,用密封袋包好置于干燥器內(nèi)備用。

        1.3.1.2 熱水浸提

        取8 g干燥的滑子菇粉末放入500 mL燒杯中,在按1∶4(體積比)的比例加入320 mL蒸餾水,并在90℃的攪拌水浴中浸提2 h,以4 000 r/min離心10 min。濾渣重復(fù)該過程共3次,將濾液合并。

        1.3.1.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

        用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60℃下冷凝濃縮至150 mL。

        1.3.1.4 乙醇沉淀

        旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)所得濃縮液加入4倍體積的95%乙醇溶液(體積比)醇沉24 h后,以4 000 r/min離心10 min,去除上清液,留沉淀。

        1.3.1.5 Sevag法脫蛋白

        醇沉得到的物質(zhì)用Sevag法脫蛋白[19],按多糖水溶液的1/5~1/4體積加入Sevag試劑(氯仿∶正丁醇為5∶1,體積比),振蕩混勻靜置直到水層和溶液層分層,去除水層和溶液層交界處的變性蛋白質(zhì),如此反復(fù),直至溶劑層與水的界面無乳白色沉淀為止。

        1.3.1.6 脫色

        脫完蛋白的多糖溶液用大孔樹脂AB-8脫色[20],將粗多糖溶液按體積比2∶1加入經(jīng)預(yù)處理樹脂于50℃水浴鍋中水浴3 h進(jìn)行脫色,并間隔攪拌,抽濾將樹脂除去,用少量水沖洗樹脂,合并的洗液即為經(jīng)過脫色的多糖溶液,凍干得滑子菇粗多糖。

        1.3.1.7 可溶性糖含量的測(cè)定

        采用苯酚-硫酸法[21]測(cè)定總糖含量。

        葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:取干燥至恒重的無水葡萄糖0.1 g,加蒸餾水溶解,然后將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶加水定容,獲得1 g/L的溶液,振搖均勻后從中用移液管量取10 mL,加入到另一支100 mL的容量瓶中,加入蒸餾水定容至刻度線,即得0.1mg/mL的標(biāo)液。

        葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:分別取0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 至 10 mL 具塞試管中,用蒸餾水補(bǔ)足1 mL,向各個(gè)試管中加入6%的苯酚溶液1 mL迅速加入5 mL濃硫酸搖勻,靜置10 min,沸水浴15 min,置于室溫冷卻,在490 nm處測(cè)吸光度OD值。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        樣品中總糖含量測(cè)定:精確稱取樣品,配成濃度為0.1 mg/mL的溶液,按上述方法測(cè)定樣品在490 nm處吸光度OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總糖含量。

        1.3.1.8 多糖提取得率的計(jì)算[22]

        多糖提取得率/%=總多糖含量(g)/滑子菇粉末質(zhì)量(g)×100

        1.3.2 提取工藝優(yōu)化

        1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

        1)提取溫度對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響

        精確稱取滑子菇粉末4.000 g,按1∶40(g/mL)的料液比加入蒸餾水,分別在不同的溫度(70、75、80、85、90℃)下提取,提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)3次,4 000 r/min離心10 min,將清液過濾,收集濾液,測(cè)定多糖的含量并計(jì)算多糖提取得率。

        2)提取時(shí)間對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響

        精確稱取滑子菇粉末4.000 g,按1∶40(g/mL)的料液比加入蒸餾水,提取溫度80℃,分別提取提取時(shí)間 60、90、120、150、180 min,提取次數(shù) 3 次,4 000 r/min離心10 min,將清液過濾,收集濾液,測(cè)定多糖的含量并計(jì)算多糖提取得率。

        3)料液比對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響

        精確稱取滑子菇粉末4.000 g,提取溫度80℃,提取時(shí)間 2 h、料液比分別為 1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1∶50(g/mL),提取次數(shù) 3次,4 000 r/min離心 10 min,將清液過濾,收集濾液,測(cè)定多糖的含量并計(jì)算多糖提取得率。

        1.3.2.2 正交試驗(yàn)

        在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,確定各變量的水平取值,進(jìn)行L9(33)的正交試驗(yàn),以滑子菇多糖提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),考察各因素對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響。

        表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal test

        2 結(jié)果與討論

        2.1 單因素試驗(yàn)

        2.1.1 提取溫度對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響

        提取溫度對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響見圖1。

        圖1 提取溫度對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響Fig.1 The influence of temperature on the extraction extraction rate

        結(jié)果如圖1所示:當(dāng)提取溫度從70℃至80℃時(shí),滑子菇多糖的提取率隨提取溫度的升高而上升;當(dāng)提取溫度從85℃至90℃時(shí),滑子菇多糖提取得率明顯下降。溫度為80℃時(shí),滑子菇多糖提取得率最大,為21.34%。多糖隨溫度變化的趨勢(shì)分析原因可能是溫度低于80℃時(shí),隨著溫度的升高,加速了分子運(yùn)動(dòng),多糖在水中的溶解度增大;當(dāng)提取溫度超過80℃后,高溫提取會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)影響其生物活性[23],多糖分子結(jié)構(gòu)鏈出現(xiàn)一定程度的降解,從而導(dǎo)致多糖提取得率下降。由試驗(yàn)結(jié)果可確定最佳的提取溫度為80℃左右。

        2.1.2 提取時(shí)間對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響

        提取時(shí)間對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響見圖2。

        圖2 提取時(shí)間對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響Fig.2 The influence of time on the extraction rate

        結(jié)果如圖2所示:當(dāng)提取時(shí)間從60 min~120 min時(shí),滑子菇多糖的提取率隨提取時(shí)間的增長(zhǎng)而上升;當(dāng)提取時(shí)間增長(zhǎng)至150 min~180 min時(shí),滑子菇多糖提取得率明顯下降。提取時(shí)間為120 min時(shí),滑子菇多糖提取得率最大,為22.07%。提取時(shí)間過短時(shí),滑子菇多糖無法充分溶出,延長(zhǎng)提取時(shí)間,可使滑子菇中可溶性多糖溶解,從而使多糖提取得率上升。達(dá)到一定時(shí)間后,細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓逐步趨于平衡,多糖提取得率不再上升,加熱狀態(tài)下過長(zhǎng)的時(shí)間可能導(dǎo)致多糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使多糖提取得率下降[24]。由試驗(yàn)結(jié)果可確定最佳的提取時(shí)間在120 min左右。

        2.1.3 料液比對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響

        料液比對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響見圖3。

        結(jié)果如圖3所示:當(dāng)料液比從1∶30(g/mL)增大到1∶40(g/mL)時(shí),滑子菇多糖的提取率逐漸增大。料液比為1∶40(g/mL)時(shí),滑子菇多糖提取得率最大,為22.13%。繼續(xù)增大料液比,滑子菇多糖的提取得率基本保持平穩(wěn),幅度變化不明顯,隨著料液比的升高,多糖得率也會(huì)相應(yīng)的增高;而當(dāng)料液比過高時(shí),多糖得率并未升高反而有所降低,可能是因?yàn)槎嗵悄芘c水以任意比互溶,水量越多,后續(xù)工藝中的提取液的濃縮成本和醇沉中的乙醇用量就越多,提取液中多糖的濃度太低時(shí),相同濃度的乙醇就越難以將多糖沉淀出來[25]。考慮后續(xù)試驗(yàn)多糖提取液需濃縮,因此,確定最佳提取的料液比為1∶40(g/mL)左右。

        圖3 料液比對(duì)滑子菇多糖提取得率的影響Fig.3 The influence of liquid ratio on the extraction rate

        2.2 正交試驗(yàn)

        由單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定各變量的水平取值,進(jìn)行L9(33)的正交試驗(yàn)。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,試驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。

        表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

        表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Orthogonal analysis of variance table

        由表2、3可知,影響滑子菇多糖提取得率的各因素次序?yàn)锽>C>A,3個(gè)因素中,即溫度對(duì)滑子菇多糖提取得率影響最大(P<0.05),其次是料液比,最后為提取時(shí)間。最優(yōu)提取工藝為A2B3C2,即提取溫度85℃,提取時(shí)間 2 h,料液比 1 ∶40(g/mL)。

        2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

        在最佳工藝條件下進(jìn)行提取多糖的驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果見表4。

        表4 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Table 4 The verification experiment of optimum extraction parameters

        試驗(yàn)結(jié)果表明:在最佳工藝條件下提取多糖,提取率達(dá)24.55%。

        3 結(jié)論

        本文以滑子菇為研究對(duì)象,對(duì)滑子菇多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過正交試驗(yàn)可知,3個(gè)因素中溫度對(duì)滑子菇多糖提取得率影響最大,其次是提取時(shí)間和料液比。并確定了熱水浸提滑子菇多糖的最佳提取條件是:提取溫度85℃,提取時(shí)間2 h,料液比1∶40(g/mL)。在此工藝條件下多糖的得率為24.55%。

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