黃飛燕 劉春艷 朱紅楓

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科（四川瀘州 646000）

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是兒童和青少年最常見的下呼吸道感染性疾病，主要引起社區(qū)獲得性肺炎，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患兒死亡［1-2］。MPP患兒早期癥狀不典型且胸片多無特異性，故臨床易漏診、誤診。MPP的發(fā)病是炎癥因子與抗炎因子共同作用的結(jié)果［3］，故研究血清細(xì)胞因子水平變化有助于MPP患兒的輔助診斷。目前，血清細(xì)胞因子診斷MPP患兒的相關(guān)報(bào)道較少，也鮮有基于血清多種細(xì)胞因子的模式識(shí)別技術(shù)對(duì)MPP的診斷和預(yù)測(cè)分析。偏最小二乘判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS?DA）是常用的模式識(shí)別技術(shù)，用于揭示多指標(biāo)的綜合作用，輔助診斷疾病?；诖?，本研究以兒科病房收治的MPP患兒為研究對(duì)象，基于血清白介素?2（interleukin?2，IL?2）、IL?4、IL?6、IL?8、IL?10，TNF?α及干擾素γ（IFN?γ）水平建立PLS?DA模型，為全面、深入了解MPP患兒體內(nèi)免疫狀況、輔助診斷MPP和預(yù)測(cè)分析提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2016年12月西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科病房收治的MPP患兒140例為觀察組，男85例、女55例，年齡2～10歲、平均5.9歲。MPP診斷參照第8版《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》［4］和兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南（2013年）修訂版［5］。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）出現(xiàn)上呼吸道感染癥狀；（2）X線檢查肺部呈多樣改變；（3）外周血白細(xì)胞數(shù)正?；蛏?，單份血清MP?IgM滴度≥1∶160或雙份血清MP?IgG抗體滴度升高≥4倍；（4）咽試紙 MP?聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）細(xì)菌性、病毒性肺炎，肺結(jié)核及支氣管哮喘患兒；（2）主要臟器疾病（如肝腎功能不全）或免疫缺陷疾病患兒；（3）入組前1個(gè)月接受過抗生素或免疫調(diào)節(jié)藥物治療的患兒。選擇同期體檢健康兒童135例為對(duì)照組，男79例，女56例，年齡1～10歲，平均5.6歲。兩組性別構(gòu)成比、年齡均具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，受試者監(jiān)護(hù)人均知情同意。

1.2 血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè) 觀察組入院治療前、對(duì)照組體檢時(shí)抽取空腹靜脈血3～5 mL，3 500 r/min離心15 min后分離血清，-20℃保存。采用 ELISA 法檢測(cè)血清 IL?2、IL?4、IL?6 IL?8、IL?10、TNF?ɑ及IFN?γ水平，配套試劑盒購于廣州展晨生物科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)MPP的診斷效能分析 繪制上述7種血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子診斷MPP的受試者工作特征（ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC）、敏感性、特異性及臨界值，評(píng)價(jià)7種血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子對(duì)MPP的診斷效能。

1.4 PLS?DA診斷和預(yù)測(cè)模型的建立 采用歸一化法即［（測(cè)定值-均值）/標(biāo)準(zhǔn)差］對(duì)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理以消除單位或量綱差異。以特征根提取前兩個(gè)PLS 成分即 t［1］和 t［2］并作圖，揭示個(gè)體的空間分布差異，并進(jìn)一步建立基于血清7指標(biāo)的PLS?DA方程。將每一個(gè)體的7項(xiàng)測(cè)定值分別帶入方程，以得分值（擬合概率P）＞0.50判定為觀察組（＜0.50判定為對(duì)照組）計(jì)算模型的診斷準(zhǔn)確率。采用20次交叉驗(yàn)證法對(duì)每一個(gè)體代入驗(yàn)證，計(jì)算模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率。以累積的因變量指數(shù)（R2Y）和交叉驗(yàn)證的有效性指數(shù)（Q2）評(píng)估PLS?DA模型的診斷和預(yù)測(cè)能力，其中R2Y和Q2均＞0.5，表明建立的模型穩(wěn)定、可靠；采用置換檢驗(yàn)判斷模型是否過度擬合，置換驗(yàn)證圖中R2的截距應(yīng)＜0.3，Q2的截距應(yīng) ＜ 0.05［6］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0和SIMCA P?11.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 觀察組血清IL?2、IL?4、IL?6、IL?8、IL?10、TNF?ɑ及IFN?γ水平均高于對(duì)照組（P＜0.05或＜0.01），見表1。

表1 疾病組和對(duì)照組血清細(xì)胞因子水平比較Tab.1 Comparison of serum level of cytokines between the disease group and the control group ±s，pg/mL

表1 疾病組和對(duì)照組血清細(xì)胞因子水平比較Tab.1 Comparison of serum level of cytokines between the disease group and the control group ±s，pg/mL

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

組別觀察組對(duì)照組t值P值IL?2 10.4±3.4*8.63±3.0 2.297 0.036 IL?4 6.97±2.2*4.81±1.8 2.326 0.023 IL?6 19.3±6.6*11.1±5.7 2.901 0.011 TNF?8 22.4±7.4#12.6±6.3 11.757 0.000 IL?10 21.3±10.3#11.6±6.2 9.613 0.000 TNF?α 23.3±8.3#14.1±6.0 2.755 0.008 IFN?γ 53.5±29.6#22.3±21.0 10.062 0.000

表2 血清7種細(xì)胞因子對(duì)MPP的診斷效能Tab.2 The diagnostic performance of serum seven cytokines for MPP pg/mL

2.2 血清7種細(xì)胞因子對(duì)MPP的診斷效能分析 7種血清細(xì)胞因子中受試者工作特征曲線下面積（AUC）最高的指標(biāo)為IL?10和IFN?γ（AUC均為0.84，均P＜ 0.05）。IL?10在臨界值為12.15 pg/mL時(shí)診斷MPP的敏感度和特異度分別為91.4%和77.0%。IFN?γ在臨界值為24.95 pg/mL時(shí)診斷MPP的敏感度和特異度分別為82.1%和82.2%（表2）。

2.3 血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子診斷MPP的PLS?DA模型 以血清7種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子建立PLS?DA模型，該模型的R2Y和Q2分別為0.597和0.556，置換驗(yàn)證圖中R2的截距為0.001，Q2的截距為-0.078（圖1）。PLS?DA模型表明，觀察組個(gè)體空間分布 離散，主要分布在橢圓的2，3象限而對(duì)照組個(gè)體分布較集中，主要分布在1，4象限，兩組個(gè)體有分離的趨勢(shì)（圖2）?；谘?種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的PLS?DA方程式為P=0.161× IL?2+0.185×IL?4+0.205 × IL?6+0.223 × IL?8+0.156 × IL?10+0.096×TNF?α +0.180×IFN?γ。該模型對(duì)觀察組和對(duì)照組的診斷準(zhǔn)確率分別為90.0%（126/140）、88.15%（119/135），內(nèi)代法預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率分別為86.4%（121/140）、87.4%（118/135）。

圖1 PLS?DA模型置換驗(yàn)證圖Fig.1 The replacement verification diagram in the PLS?DA model

圖2 基于血清7種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的PLS?DA模型Fig.2 The PLS?DA model based on serum seven inflammation related cytokines

3 討論

人體免疫系統(tǒng)對(duì)入侵體內(nèi)的MP可產(chǎn)生免疫反應(yīng)，其中細(xì)胞免疫在MPP的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。MPP感染后血清炎癥相關(guān)因子如IL?1、IL?6、IL?12、IL?17、TNF?α及IFN?γ等顯著升高，出現(xiàn)細(xì)支氣管上皮細(xì)胞空泡變性與細(xì)胞毒作用并引起氣道高反應(yīng)性和持續(xù)氣道阻塞［7］。研究［8］表明，MPP患兒血清IL?6、IL?8水平顯著增高且與預(yù)后密切相關(guān)，其中血清IL?6水平可反映肺功能和肺部感染的嚴(yán)重程度［9］。LI等［10］研究表明，IL?6對(duì)MPP有較高的診斷效能（AUC為0.729，95%CI為0.678～0.780），敏感性和特異性分別為62.8%、95.3%，與本研究結(jié)果相似。炎癥因子IL?8對(duì)中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞均可產(chǎn)生強(qiáng)烈的趨化作用，炎癥細(xì)胞在受累組織聚積和浸潤(rùn)并釋放活性物質(zhì)，導(dǎo)致組織損傷［10］。IL?10是抗炎因子，可抑制TNF?α、IL?6和IL?8的釋放而對(duì)抗感染［11］，故本研究疾病組MPP患兒血清IL?8和IL?10水平均顯著高于對(duì)照組。IFN?γ主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，通過活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞清除MP，促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞抗MP感染作用［12］，而TNF?α是一種炎癥介質(zhì)，其免疫作用與其血清水平高低有關(guān)，高水平TNF?ɑ導(dǎo)致組織損傷［13］。本研究中，疾病組血清 IL?2、IL?4、IL?6、IL?8、IL?10、TNF?α 及IFN?γ水平均高于對(duì)照組，表明MP感染可引起機(jī)體炎癥因子和抗炎因子水平升高，在組織損傷中和修復(fù)中發(fā)揮潛在作用。

MPP的發(fā)病過程是炎癥因子和抗炎因子共同作用的過程，孤立地比較各因子的水平變化尚不能全面了解MPP患兒的免疫狀態(tài)。PLS?DA是代謝組學(xué)中常用的模式識(shí)別技術(shù)，可全面、深入了解疾病狀態(tài)下患者體內(nèi)多種代謝物的變化過程，有助于疾病的輔助診斷和預(yù)測(cè)分析［14］。目前，尚未見PLS?DA模型用于MPP患兒免疫功能研究和輔助診斷的相關(guān)報(bào)道。本研究中MPP患兒體內(nèi)免疫平衡被打破而正常對(duì)照組兒童體內(nèi)免疫處于平衡狀態(tài)，故PLS?DA模型中個(gè)MPP患兒分布更離散且空間分布完全不同于正常兒童。MPP時(shí)細(xì)胞因子IL?1、IL?12和IL?17等也參與了機(jī)體的免疫功能調(diào)節(jié)［7］，故本研究基于血清7種細(xì)胞因子的PLS?DA模型尚不能完全揭示MPP時(shí)患兒的免疫狀況，表現(xiàn)為PLS?DA圖中部分患兒分布與對(duì)照組兒童有重疊。此外，本研究中PLS?DA模型的R2Y和Q2均＞0.50，診斷和預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率均較高（86.4%～90.0%），表明該模型較穩(wěn)定、可靠且具有較高的診斷和預(yù)測(cè)能力；置換驗(yàn)證圖中R2和Q2的截距均＜0.05，故PLS?DA模型也無過度擬合現(xiàn)象。

本研究中，基于血清7種細(xì)胞因子的PLS?DA模型較全面地揭示了MPP時(shí)患兒體內(nèi)的免疫功能狀態(tài)，有助于MPP的輔助診斷和預(yù)測(cè)分析。盡管如此，MPP患兒的免疫功能狀態(tài)與患兒感染MP的時(shí)間、用藥劑量、種類和療效等密切相關(guān)。因此后續(xù)應(yīng)增加樣本量及細(xì)胞因子種類，全面、深入研究MPP患兒不同時(shí)期的免疫狀況，為全面揭示MPP時(shí)患兒體內(nèi)的免疫功能狀態(tài)、鑒別診斷和監(jiān)測(cè)MPP患兒治療效果、調(diào)整用藥方案等提供幫助。

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