張力力 王樹(shù)水 辛穎 張智偉 李渝芬

1南方醫(yī)科大學(xué)（廣州 510515）；2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省心血管病研究所心兒科（廣州 510080）

特發(fā)性心肌病是原發(fā)于心肌病變的心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常，包括擴(kuò)張型心肌病（dilated cardio?myopathy，DCM）、肥厚型心肌?。╤ypertrophic car?diomyopathy，HCM）、左室心肌致密化不全（left ventricular noncompaction，LVNC）等。DCM表現(xiàn)為心臟擴(kuò)大，心室收縮功能減退，伴或不伴有充血性心力衰竭，常有心律失常，可伴發(fā)栓塞、猝死等并發(fā)癥。HCM是以不能解釋的心室肥厚為特征的心肌疾病，早期伴心臟舒張功能不全，晚期收縮功能亦受影響，左室流出道梗阻是該病的常見(jiàn)特征，它是最常見(jiàn)的年輕人心源性猝死的原因之一。LVNC是以心室內(nèi)疏松的肌小梁和深陷的隱窩為特征的心肌病，常累積左室，又稱海綿狀心肌、竇狀心肌持續(xù)狀態(tài)等。近年來(lái)，隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，從基因?qū)用嬖\斷疾病，分析基因突變與臨床表型的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)［1］。本文對(duì)我院接診的43例無(wú)血緣關(guān)系的特發(fā)性心肌病兒科患者進(jìn)行心肌病相關(guān)基因進(jìn)行研究，系首次對(duì)特發(fā)性心肌病患兒進(jìn)行多達(dá)91個(gè)心肌病相關(guān)基因的測(cè)序分析，以明確特發(fā)性心肌病患兒致病基因及其突變特點(diǎn)，初步分析基因突變與臨床表型的關(guān)系，探討基因突變?cè)谛募〔≡\斷、預(yù)后判斷、指導(dǎo)治療方面的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 廣東省人民醫(yī)院從2015年1月至2017年3月共收治43例無(wú)血緣關(guān)系心肌病患兒（DCM 14例，HCM12例，LVNC17例），全部病例經(jīng)酶學(xué)及串聯(lián)質(zhì)譜檢查等排除代謝性心肌病，經(jīng)臨床、超聲心動(dòng)圖檢查確診。DCM中，男8例，女6例，年齡0.3～14（6.4±5.4）歲。HCM中，男4例，女8例，年齡0.3～14（6.3±4.9）歲。LVNC中，男7例，女10例，年齡0.2±13（4.0±4.5）歲。本研究經(jīng)廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒及直系親屬，均由其本人或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 基因測(cè)序分析

1.2.1 二代基因測(cè)序 抽取靜脈血2 mL，采用QIAamp DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）抽提基因組DNA。提取的DNA用DNA酶片段化后用磁珠法進(jìn)行純化，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并連接上接頭序列，使用 TruSight One Sequencing Panel（illumina Inc，USA）試劑盒經(jīng)2次捕獲及純化，再經(jīng)PCR擴(kuò)增和純化后獲得的最終文庫(kù)在Nextseq500測(cè)序儀（illumina Inc，USA）上進(jìn)行外顯子區(qū)及外顯子與內(nèi)含子交接區(qū)的二代測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道［2-4］和HGMD（Human Gene Mutation Database）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Men）等數(shù)據(jù)庫(kù)選取與心肌病相關(guān)或可能相關(guān)的91個(gè)基因進(jìn)行分析。該91個(gè)基因?yàn)?AARS2、ABCC9、ACTC1、ACTN2、AGK、ANKRD1、BAG3、CALR3、CASQ2、CAV3、CHRM2、COX15、 CRYAB、 CSRP3、 CTF1、 DES、 DMD、DNAJC19、DOLK、DSC2、DSG2、DSP、DTNA、ELAC2、EMD、EYA4、FHL1、FHL2、FKTN、FLT1、FOXD4、FXN、GATAD1、GLA、ILK、ISL1、JPH2、JUP、KLF10、LAMA2、LAMA4、LAMP2、LDB3、LMNA、MAP2K2、MRPL3、MTO1、MURC、MYBPC3、MYH6、MYH7、MYL2、MYL3、MYLK2、MYO6、MYOM1、MYOZ2、MYPN、NDUFAF1、NDUFS7、NEBL、NEXN、PDLIM3、PKP2、PLN、PRKAG2、PSEN1、PSEN2、RBM20、RYR2、SCN5A、SGCA、SGCD、SLC25A3、SLC25A4、SRI、SYNE1、SYNM、TAZ、TCAP、TGFB3、TMEM43、TMPO、TNNC1、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、TTR、TXNRD2、VCL。用BWA算法比對(duì)到參考序列（UCSC hg19），采用儀器默認(rèn)設(shè)置，使用ANNOVAR工具對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋。使用千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)、ESP6500數(shù)據(jù)庫(kù)、HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選、注釋；使用SIFT、Polyphen?2軟件進(jìn)行錯(cuò)義變異的生物信息學(xué)分析。綜合各個(gè)基因變異的頻率、基因功能、遺傳方式、文獻(xiàn)報(bào)道等信息，并結(jié)合患兒的臨床表型信息，篩選候選突變。根據(jù)2015年“美國(guó)遺傳學(xué)與基因組學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）”提出的指南得出致病性判斷，基因突變的致病性程度分為5檔，即致病突變、可疑致病突變、臨床意義未明、可能無(wú)害、無(wú)害［5］。

1.2.3 Sanger測(cè)序驗(yàn)證 針對(duì)候選突變的位點(diǎn)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，對(duì)其中收集到靜脈血的一代親屬進(jìn)行相應(yīng)位點(diǎn)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 特發(fā)性心肌病基因突變情況 43例患兒（DCM 14例，HCM 12例，LVNC 17例）中，20例（46.5%）檢測(cè)到 ACTC1、DSG2、ELAC2、FKTN、HCN4、LAMA2、LMNA、MTO1、MYBPC3、MYH6、MYH7、NEBL、NEXN、NKX2?5、PLN、PSEN2、RAF1、SCN5A、TNNI3、TNNT2、TPM1、TTN、VCL等 23個(gè)基因上的致病突變和可疑致病突變，共檢測(cè)到28個(gè)致病突變或可疑致病突變位點(diǎn)，未見(jiàn)有重復(fù)出現(xiàn)的突變位點(diǎn)（表1）。其中6例患兒同時(shí)檢測(cè)到2個(gè)基因上致病突變或可疑致病突變，2例患兒同時(shí)檢測(cè)到1個(gè)基因的2個(gè)致病突變或可疑致病突變。對(duì)其中24個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行父母測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，由父或母遺傳的有19個(gè)，新發(fā)突變5個(gè)。致病突變和可疑致病突變中，突變方式以錯(cuò)義突變?yōu)橹?，?0.0%，其次為移碼突變（17.8%）、無(wú)義突變（14.3%）、剪接突變（10.7%）、外顯子和內(nèi)含子交接區(qū)的微小缺失突變（3.5%）。此外，19例（44.1%）患兒檢測(cè)到臨床意義未明的突變位點(diǎn)。

2.2 DCM與基因突變 14例DCM患兒中，5例（35.7%）檢測(cè)到7個(gè)基因上的8個(gè)致病突變及可疑致病突變位點(diǎn)，余9例均檢測(cè)到臨床意義未明的突變。1例DCM患兒中檢測(cè)到FKTN基因上的2個(gè)位點(diǎn)的突變，F(xiàn)KTN?L166P來(lái)自于父親，F(xiàn)KTN?F369fs來(lái)自于母親，父母均無(wú)心臟擴(kuò)大或心力衰竭的表現(xiàn)，但該患兒就診時(shí)即有嚴(yán)重的心力衰竭。

2.3 HCM與基因突變 12例HCM患兒中的7例（58.3%）檢測(cè)到10個(gè)基因上的11個(gè)致病及可疑致病突變位點(diǎn)，3例檢測(cè)臨床意義未明的突變。對(duì)其中1例有暈厥史，且就診2年后因心力衰竭死亡的患兒（病例17，圖1）進(jìn)行家系分析發(fā)現(xiàn)，其母親、妹妹、外婆攜帶致病突變MYH7?R663C，其父親、伯父攜帶可疑致病突變MYH7?R1050*，均未患病，其姐姐診斷為HCM已于4歲猝死，未能檢測(cè)到其姐姐基因。1例患兒父親不明原因猝死，后發(fā)現(xiàn)該患兒心肌肥厚且檢測(cè)到致病突變TNNT2?R130C，患兒母親未攜帶此突變。還有1例HCM患兒檢測(cè)到PKP2基因上的R284G位點(diǎn)突變，該位點(diǎn)根據(jù)ACMG指南判斷為臨床意義未明，但通過(guò)患兒家系驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)為新發(fā)突變，其父、母均未攜帶此突變位點(diǎn)。

表1 特發(fā)性心肌病基因型與臨床表型Tab.1 Genotype and phenotype of cadiomyopathy

2.4 LVNC與基因突變 在17例LVNC的患兒中，8例（47%）檢測(cè)到9個(gè)基因上的9個(gè)致病及可疑致病突變位點(diǎn)。7例檢測(cè)到臨床意義未明的突變，2例患兒僅檢測(cè)到無(wú)害和可能無(wú)害的突變位點(diǎn)。對(duì)1例（病例9，圖2）患兒進(jìn)行家系分析發(fā)現(xiàn)，該患兒攜帶的突變ACTC1?c.616+1G＞C為新發(fā)突變，其兄長(zhǎng)、父、母均不攜帶此突變。1例合并有竇性心動(dòng)過(guò)緩的患兒檢測(cè)到致病突變HCN4?G482R。

3 討論

本文首次對(duì)特發(fā)性心肌病患兒進(jìn)行多達(dá)91個(gè)心肌病相關(guān)基因的測(cè)序分析，明確特發(fā)性心肌病患兒致病基因及其突變特點(diǎn)，初步分析基因突變與臨床表型的關(guān)系，探討基因突變?cè)谛募〔≡\斷、預(yù)后判斷、指導(dǎo)治療方面的作用。研究發(fā)現(xiàn)DCM與48個(gè)基因的突變有關(guān)，40%～50%的家族性DCM可以檢測(cè)到基因突變［6］，其中最常見(jiàn)的突變基因?yàn)門TN，約占20%，其次為L(zhǎng)MNA（6%），MYH7（4.2%），MYH6（3 ～ 4%），SCN5A（2 ～ 4%）等［7］，本研究中14例DCM患兒中5例檢測(cè)到致病基因突變和可疑致病突變，大部分為非家族性的DCM，我們檢測(cè)到常見(jiàn)基因LMNA，還檢測(cè)到TPM1、VCL、PLN、DSG、PSEN2、FKTN 等致病基因。在HCM中，已經(jīng)報(bào)道了26個(gè)致病基因，50%～60%的家族性HCM，20%～30%的非家族性HCM可以檢測(cè)到基因突變［8］。研究表明在HCM的致病基因中 MYH7、MYBPC3約各占 40%，TNNI3、TNNT2約各占 5%，TPM1約占 2%［9］，本研究在12例HCM患兒中7例檢測(cè)到致病突變及可疑致病突變。我們也同樣檢測(cè)到MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3上的突變位點(diǎn)，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。此 外 ，還 檢 測(cè) 到 TTN、RAF1、PSEN2、LAMA2、NEXN、MTO1等基因的突變位點(diǎn)。LVNC與15個(gè)基因突變相關(guān)，15% ～50%的LVNC為家族遺傳［10］。常見(jiàn)的LVNC致病基因有DTNA、MIB1、PRDM16、TNNT2、TAZ等［11］。本研究檢測(cè)到的致病基因包括 ACTC1、ELAC2、HCN4、LMNA、MYH6、NEBL、NKX2?5、SCN5A、TTN。

圖1 1例HCM患兒超聲心動(dòng)圖及基因測(cè)序圖Fig.1 Images for a patient of HCM

圖2 1例LVNC患兒超聲心動(dòng)圖及基因測(cè)序圖Fig.2 Images for a patient of LVNC

根據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇了與心肌病相關(guān)或可能相關(guān)的91個(gè)基因進(jìn)行測(cè)序分析［1-3］。在本研究的43例特發(fā)性心肌病患兒中，20例（46.5%）檢測(cè)到致病或可疑致病突變位點(diǎn)，19例（44.1%）檢測(cè)到目前臨床意義尚未明確的突變位點(diǎn)。這些研究結(jié)果提示，將心肌病相關(guān)基因檢測(cè)用于協(xié)助診斷特發(fā)性心肌病是可行的。特發(fā)性心肌病患兒中大部分都能檢測(cè)到突變位點(diǎn)，但其中存在臨床意義未明的位點(diǎn)，我們的研究結(jié)果顯示，這些臨床意義目前尚未明確的突變位點(diǎn)很可能與患兒的發(fā)病密切相關(guān)，需要今后進(jìn)一步的分析。本研究中，1例HCM患兒檢測(cè)到PKP2基因上的R284G位點(diǎn)突變。雖然根據(jù)目前的判斷標(biāo)準(zhǔn)，該突變尚定義為臨床意義未明的突變位點(diǎn)，但該位點(diǎn)為新發(fā)突變，具有較強(qiáng)的致病證據(jù)，很可能與HCM發(fā)病相關(guān)。在既往研究中，PKP2?R284位點(diǎn)未見(jiàn)有引起HCM的報(bào)道，但PKP2基因的突變影響橋粒功能，是引起右室心肌病的常見(jiàn)致病基因，因而我們懷疑R284G為新發(fā)現(xiàn)的HCM的致病位點(diǎn)，需要進(jìn)行下一步的驗(yàn)證。

文獻(xiàn)報(bào)道，部分基因突變位點(diǎn)與病變程度相關(guān)。有研究結(jié)果顯示攜帶一個(gè)基因上的雙突變位點(diǎn)是患兒預(yù)后不良的標(biāo)志［12-13］。本研究中1例DCM患兒攜帶FKTN的雙突變位點(diǎn)，其分別來(lái)自于父母，該患兒父母無(wú)心臟擴(kuò)大或心力衰竭等表現(xiàn)，但患兒就診時(shí)即有嚴(yán)重的心力衰竭，且治療后未見(jiàn)明顯好轉(zhuǎn)，支持其預(yù)后不良的特點(diǎn)。另1例HCM患兒攜帶有MYH7的雙突變，她是本研究HCM病例中唯一一例死亡的患者，該患兒10歲時(shí)就有胸痛、心衰等表現(xiàn)，12歲因心力衰竭死亡，其姐姐在4歲因HCM猝死，支持文獻(xiàn)報(bào)道的該類病例具有病情重、預(yù)后差的特點(diǎn)。因此，對(duì)于檢測(cè)到一個(gè)基因上雙突變位點(diǎn)的病例，應(yīng)密切隨訪，并早期告知家屬其預(yù)后情況。HCM中，TNNT2的突變位點(diǎn)R92Q，R92W，R130C等引起的心肌肥厚不嚴(yán)重，但易引發(fā)心源性猝死［14］。本研究中檢測(cè)到的TNNT2?R130C的突變的患兒心肌肥厚亦不嚴(yán)重，其母親未攜帶此突變，父親已于30歲猝死，高度懷疑其猝死與此突變相關(guān)，該患兒目前無(wú)臨床癥狀，但根據(jù)其基因型與家族猝死史，臨床應(yīng)予以密切關(guān)注，加強(qiáng)隨訪，必要時(shí)應(yīng)早期應(yīng)用置入性心臟除顫器預(yù)防猝死。MILANO等［15］曾發(fā)現(xiàn)HCN4?G482R突變的LVNC患者常合并有竇性心動(dòng)過(guò)緩，本研究中有1例LVNC患兒也檢測(cè)到了HCN4?G482R突變，該患兒同樣具有顯著的心動(dòng)過(guò)緩，而本文中其他LVNC病例均不合并明顯的竇性心動(dòng)過(guò)緩。

由于受到研究經(jīng)費(fèi)、研究時(shí)間等方面的限制，本研究尚有一些突變位點(diǎn)目前未能明確是否致病，突變位點(diǎn)與臨床表型的關(guān)系也未得到大樣本的驗(yàn)證。今后，將對(duì)研究病例進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪、擴(kuò)大樣本量，以上述問(wèn)題進(jìn)行深入研究。

［1］WALDM LLER S，SCHROEDER C，STURM M，et al.Target?ed 46?gene and clinical exome sequencing for mutations causing cardiomyopathies［J］.Mol Cell Probe，2015，29（5）：308?314.

［2］中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)，中華心血管病雜志編輯委員會(huì).遺傳性心臟離子通道病與心肌病基因檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)［J］.中華心血管病雜志，2011，39（12）：1073?1082.

［3］ACKERMAN M J，PRIORI S G，WILLEMS S，et al.HRS/EH?RA expert consensus statement on the state of genetic testing for the channelopathies and cardiomyopathies：this document was developed as a partnership between the Heart Rhythm Soci?ety（HRS）and the European Heart Rhythm Association（EH?RA）［J］.Europace，2011，13（8）：1077?1109.

［4］TEEKAKIRIKUL P，KELLY M A，REHM H L，et al.Inherit?ed cardiomyopathies：molecular genetics and clinical genetic testing in the postgenomic era［J］.J Mol Diagn，2013，15（2）：158?170.

［5］RICHARDS S，AZIZ N，BALE S，et al.Standards and guide?lines for the interpretation of sequence variants：a joint consen?sus recommendation of the American College of Medical Genet?ics and Genomics and the Association for Molecular Pathology［J］.Genet Med，2015，17（5）：405?424.

［6］HERSHBERGER R，MORALES A.Dilated Cardiomyopathy Overview ［EB/OL］. http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK 1309，2015?09?24.

［7］HERSHBERGER R E，HEDGES D J，MORALES A.Dilated cardiomyopathy：the complexity of a diverse genetic architecture［J］.Nat Rev Cardiol，2013，10（9）：531.

［8］CIRINO A，HO C.Hypertrophic Cardiomyopathy Overview［EB/OL］.http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1768，2017?3?10.

［9］KAPPLINGER J D，LANDSTROM A P，BOS J M，et al.Distin?guishing Hypertrophic Cardiomyopathy?Associated Mutations from Background Genetic Noise［J］.J Cardiovasc Transl，2014，7（3）：347?361.

［10］OECHSLIN E，JENNI R.Left ventricular non?compaction revis?ited：a distinct phenotype with genetic heterogeneity？［J］.Eur Heart J，2011，32（12）：1446?1456.

［11］BENNETT C E，F(xiàn)REUDENBERGER R.The current approach to diagnosis and management of left ventricular noncompaction cardiomyopathy：review of the literature［J］.Cardiol Res Prac?tice，2016，2016：1?7.

［12］FOUREY D，CARE M，SIMINOVITCH K A，et al.Prevalence and Clinical Implication of Double Mutations in Hypertrophic Cardiomyopathy.CLINICAL PERSPECTIVE［J］.Circulation：Cardiovascular Genetics，2017，10（2）：e001685.

［13］WANG J，XU S，ZHOU H，et al.A Novel Mutation of the Beta Myosin Heavy Chain Gene Responsible for Familial Hypertro?phic Cardiomyopathy［J］.Clin Cardiol，2009，32（9）：E16?E21.

［14］SONG L，ZOU Y，WANG J，et al.Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy［J］.Clin Chim Ac?ta，2005，351（1?2）：209?216.

［15］MILANO A，VERMEER A M，LODDER E M，et al.HCN4 mutations in multiple families with bradycardia and left ventricu?lar noncompaction cardiomyopathy［J］.J Am Coll Cardiol，2014，64（8）：745?756.