郭朦朦，陳慧潔，馮麗貞，楊澤慧，陸 芝，唐 芬

(福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002)

桉樹(Eucalyptusspp.)是世界三大速生造林樹種之一[1]。桉樹焦枯病(Cylindrodadiumleaf blight)是一種世界性病害，嚴(yán)重危脅桉樹生產(chǎn)[2]。如今生產(chǎn)上對(duì)桉樹焦枯病的防治主要采取化學(xué)防治，但因森林面積大，森林病害具有長(zhǎng)時(shí)性和隱蔽性，采用化學(xué)防治不符合社會(huì)經(jīng)濟(jì)的實(shí)際情況，不僅收效甚微，而且導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境[3]。同時(shí)藥物的重復(fù)使用使病菌產(chǎn)生抗藥性，其防治效果大大下降[4]。因此,為促進(jìn)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，從植物的抗病防御機(jī)制入手，提高寄主抗病性是桉樹焦枯病防治切實(shí)可行的重要途徑。

茉莉酸甲酯(MeJA)是新確認(rèn)的一種植物體的植物生長(zhǎng)物質(zhì)，其生理功能與植物體的抗病防御系統(tǒng)有關(guān)，在病蟲害防御等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起信使作用[5-11]，且MeJA具有高效、對(duì)環(huán)境無(wú)毒害、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)不同抗病種系桉樹的SOD活性、PPO活性及其同工酶譜均可作為早期鑒定桉樹對(duì)焦枯病抗病性的重要生理生化指標(biāo)[12]；在構(gòu)建抗病種系“巨赤桉9224”(Eucalyptusgrandis×E.tereticornisM1)在焦枯病菌(C.quinqueseptatumMorgan)侵染下的cDNA正向差減文庫(kù)上調(diào)表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)茉莉酸結(jié)構(gòu)域mRNA[13]；用桉樹焦枯病菌Ca.pseudoreteaudii侵染抗病種系“尾細(xì)桉M1”后，其蛋白組和表達(dá)譜分析也表明茉莉酸(JAs)生物合成相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)[12]。前期的這些研究都暗示了JAs信號(hào)途徑參與了桉樹對(duì)焦枯病菌的響應(yīng)。由于桉樹焦枯病主要為害桉樹幼苗和4 a生以下桉樹幼林。因此，本試驗(yàn)以前期研究的11個(gè)桉樹主栽種系中感病品種“巨桉3號(hào)”和中抗品種“巨尾桉廣9”的組培苗為試驗(yàn)材料，通過檢測(cè)MeJA誘導(dǎo)抗病性弱的桉樹后體內(nèi)抗病防御酶應(yīng)答，篩選出MeJA誘導(dǎo)桉樹對(duì)焦枯病抗性的最佳濃度及抗性的持效期，為桉樹焦枯病防治工作提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

感病種系“巨桉3號(hào)”(Eucalyptusgrandis3) 和中抗種系“巨尾桉廣9”(E.grandis3×E.urohyllaguang 9)組培苗為材料[14]，于2012年5月取發(fā)育正常、無(wú)病害癥狀、苗高20 cm左右的組培苗移植于福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所試驗(yàn)地，株行距為30 cm×40 cm，確保苗木生長(zhǎng)健康，2個(gè)月后用于試驗(yàn)。

1.2 供試病原菌

強(qiáng)致病力焦枯病菌Ca.pseudoreteaudii[15]由福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 茉莉酸甲酯對(duì)焦枯病菌的毒性檢測(cè) 采用抑菌圈法[16]。取0.1 mL濃度為106個(gè)/mL的焦枯病菌懸浮液于PDA培養(yǎng)基上(d=9 cm)，均勻涂抹。待表面無(wú)液滴后，將浸有不同濃度MeJA(0.05,0.1,0.5,1 mmol/L)的圓形濾紙片(d=6 mm)放入培養(yǎng)皿中，以浸有無(wú)菌水的濾紙片為對(duì)照，每個(gè)培養(yǎng)皿同時(shí)放入同一濃度的圓形濾紙片3片，每濃度重復(fù)3次。在25 ℃下培養(yǎng)72 h后觀察記錄濾紙片圓片周圍抑菌圈的有無(wú)及大小。

1.3.2 茉莉酸甲酯處理及接菌 接菌前3 d，用0(Control)，0.05，0.1，0.5，1 mmol/L的MeJA(內(nèi)含0.1%的Tween20)進(jìn)行葉面噴施處理，植株下面的土壤用聚乙烯塑料覆蓋，每天噴霧1次，以看到液滴從葉面滴落為止，連續(xù)3次后，用濃度為5×104個(gè)/mL的孢子懸浮液進(jìn)行無(wú)傷接種，同時(shí)用無(wú)菌水濕棉球保濕，外面覆蓋透明塑料薄膜。接種后24 h[14]取成熟度一致的植株頂部第一完全展開葉片用于SOD和PPO活性的測(cè)定。

1.3.3 茉莉酸甲酯對(duì)焦枯病抗性的測(cè)定 用1.3.2中篩選出的最適MeJA誘導(dǎo)濃度對(duì)“巨桉3號(hào)”和“巨尾桉廣9”進(jìn)行葉面噴施處理，在處理后的1，3，5，7，10和15 d，用濃度為5×104個(gè)/mL的孢子懸浮液進(jìn)行無(wú)傷接種，每次接種24 h后，取成熟度一致的植株頂部第一完全展開葉片用于SOD和PPO活性測(cè)定。

1.3.4 多酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性的測(cè)定 多酚氧化酶(PPO)采用三氯乙酸比色法[17]。超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2003軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉酸甲酯對(duì)焦枯病菌菌落生長(zhǎng)情況的影響

在浸有0.05,0.1,0.5,1 mmol/L MeJA濃度的濾紙片圓片周圍無(wú)明顯抑菌圈形成(圖1)，可以得出，不同濃度的MeJA對(duì)桉樹焦枯病菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯的直接毒性。

a，b，c，d和e分別代表對(duì)照組，0.05 mmol/L，0.1 mmol/L，0.5 mmol/L和1 mmol/L MeJA濃度a,b,c,d and e stand for control,0.05 mmol/L,0.1 mmol/L,0.5 mmol/L and 1 mmol/L of MeJA respectively圖1 茉莉酸甲酯對(duì)焦枯病菌菌落生長(zhǎng)情況的影響Fig.1 Toxicity assay of different concentrations of MeJA to Ca. pseudoreteaudii

2.2 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后接種焦枯病菌對(duì)PPO活性的影響

圖2顯示，不同濃度MeJA誘導(dǎo)不同抗病類型桉樹后，其葉片的PPO活性均隨MeJA濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，當(dāng)濃度為0.1 mmol/L時(shí)，PPO活性最高。從圖2還可看出，感病種系“巨桉3號(hào)”誘導(dǎo)前PPO活性比中抗種系“巨尾桉廣9”低，這與課題組前期研究結(jié)果一致[19]，但低濃度MeJA誘導(dǎo)后PPO活性增幅“巨桉3號(hào)”均高于“巨尾桉廣9”，“巨桉3號(hào)”分別比對(duì)照高出35.1%、90.3%和47.4%，而“巨尾桉廣9”才高出21.9%、45.5%和13.4%；高濃度(1 mmol/L)的MeJA使PPO活性下降，并低于誘導(dǎo)前，分別比對(duì)照降低了18.2%和4.8%?？梢?，不同濃度MeJA對(duì)桉樹抗病性誘導(dǎo)的效果不同，低濃度MeJA感病種系“巨桉3號(hào)” 誘導(dǎo)效果比中抗種系“巨尾桉廣9”好。

圖2 不同濃度MeJA處理后接種焦枯病菌時(shí)桉樹葉片的PPO活性變化Fig.2 The PPO activity change in eucalyptus leaves after inducing with different concentrations of MeJA for 3 days and then inoculating Ca. pseudoreteaudii

圖3 不同濃度MeJA處理后接種焦枯病菌時(shí)桉樹葉片的SOD活性變化Fig.3 The SOD activity change in eucalyptus leaves when induced with different concentrations of MeJA for 3 days and then inoculated Ca. pseudoreteaudii

2.3 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后接種焦枯病菌對(duì)SOD活性的影響

不同濃度MeJA誘導(dǎo)并接種焦枯病菌后，“巨桉3號(hào)”和 “巨尾桉廣9”葉片SOD活性變化趨勢(shì)與PPO活性變化趨勢(shì)基本一致，如圖3所示。只是酶活性增幅更高。MeJA從低到高各濃度誘導(dǎo)，“巨桉3號(hào)” SOD活性比對(duì)照相分別為增長(zhǎng)了47.9%、112.9%和37.9%，而“巨尾桉廣9”為28.1%、63.7%和34.5%，當(dāng)濃度為1 mmol/L時(shí)，“巨桉3號(hào)” 和“巨尾桉廣9”的SOD活性最低，分別比對(duì)照下降了7.9%和9.4%。進(jìn)一步驗(yàn)證了低濃度MeJA能誘導(dǎo)桉樹對(duì)焦枯病的抗性，且最佳濃度為0.1 mmol/L，同時(shí)感病種系“巨桉3號(hào)” 誘導(dǎo)效果強(qiáng)于中抗種系“巨尾桉廣9”。

2.4 0.1 mmol/L MeJA誘導(dǎo)后不同時(shí)間接種對(duì)桉葉PPO活性的影響

從圖4中可以看出，“巨桉3號(hào)”和 “巨尾桉廣9” 經(jīng)最適濃度0.1 mmol/L MeJA誘導(dǎo)后在1、3、5、7、10和15 d不同時(shí)間接種葉片的PPO活性都有提高，到第5天時(shí)達(dá)到最大值，與第1天相比分別高出76%和67.5%。隨后兩品種的酶活性逐漸下降，但均高于第1天?！熬掼?號(hào)”第7～10天略有回升，隨后又開始下降，到第15天時(shí)，酶活性略高于第1天。總之，“巨桉3號(hào)”誘導(dǎo)后的PPO活性高于“巨尾桉廣9”。

2.5 0.1 mmol/L MeJA誘導(dǎo)后不同時(shí)間接種對(duì)桉葉SOD活性的影響

經(jīng)最適濃度誘導(dǎo)后不同時(shí)間接種“巨桉3號(hào)”和 “巨尾桉廣9”葉片SOD活性變化趨勢(shì)與PPO活性變化趨勢(shì)基本一致(圖5)，呈先上升后下降的趨勢(shì)，并都于第5天時(shí)酶活性達(dá)到最大值，與第1天相比分別高出98.6%和70.5%，均達(dá)到顯著水平；而后，兩者的酶活性開始下降，至第15天時(shí)，“巨桉3號(hào)”和 “巨尾桉廣9”的酶活性分別降至20.2 U/(g·min)和16.9 U/(g·min)，但仍高于第1天。這進(jìn)一步驗(yàn)證了MeJA誘導(dǎo)桉樹對(duì)焦枯病抗性的最佳表達(dá)為誘導(dǎo)后第5天，且其對(duì)感病種系“巨桉3號(hào)” 的誘導(dǎo)效果較中抗種系“巨尾桉廣9”的好。

圖4 最適濃度MeJA誘導(dǎo)后不同時(shí)間接種焦枯病菌下桉樹葉片的PPO酶活性變化Fig.4 The PPO activity change in eucalyptus leaves when induced with the optimal concentration of MeJA for 1,3,5,7,10 and 15 d respectively then inoculated Ca. pseudoreteaudii

圖5 最適濃度MeJA誘導(dǎo)后不同時(shí)間接種焦枯病菌下桉樹葉片的SOD酶活性變化Fig.5 The SOD activity change in eucalyptus leaves when induced with the optimal concentration of MeJA for 1,3,5,7,10 and 15 d respectively then inoculated Ca. pseudoreteaudii

3 結(jié)論與討論

茉莉酸類化合物是存在植物體中的一類內(nèi)源的植物生長(zhǎng)物質(zhì)[10-11]。茉莉酸甲酯能調(diào)節(jié)植物體抗氧化酶系統(tǒng)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)及次生物質(zhì)合成，提高植物的抗病蟲害性[20]。馮麗貞等[19,21]對(duì)福建省11個(gè)不同抗病類型桉樹主栽種系研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論健康葉還是接種后的病葉，多酚類物質(zhì)含量、黃酮類化合物含量、多酚氧化酶活性、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性的水平可作為桉樹對(duì)焦枯病抗病性的早期鑒定的生化指標(biāo)。本研究對(duì)感病種系“巨桉3號(hào)”和中抗種系“巨尾桉廣9”葉片噴施不同濃度的MeJA誘導(dǎo)后接種焦枯病菌，發(fā)現(xiàn)除高濃度MeJA(1 mmol/L)外，其余各濃度處理的桉樹葉片中超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性均隨MeJA濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)，且都在濃度為0.1 mmol/L處達(dá)到最大值；用該濃度處理不同抗病類型的桉葉并間隔不同時(shí)間接種后發(fā)現(xiàn)，桉葉的防御反應(yīng)變化與接種時(shí)間間隔有關(guān)，且在第5天時(shí)多酚氧化酶和超氧化物歧化酶的酶活性最高，隨后呈現(xiàn)出下降的變化趨勢(shì)，表明誘導(dǎo)桉樹對(duì)焦枯病抗性的最佳表達(dá)為誘導(dǎo)后第5天。該結(jié)果顯示低濃度MeJA能夠誘導(dǎo)桉樹抗病保護(hù)酶活性的表達(dá)，有效地抑制焦枯病菌對(duì)桉樹的侵害，從而提高桉樹對(duì)焦枯病抗性。

植物抗性分為基礎(chǔ)抗性和誘導(dǎo)抗性，基礎(chǔ)抗性是由遺傳決定的。因此，誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性是植物的一種重要防病機(jī)制，對(duì)于生長(zhǎng)性狀優(yōu)良但感病的桉樹無(wú)性系來(lái)說，利用誘導(dǎo)抗性大幅度地提高其對(duì)于焦枯病的抗性、降低發(fā)病程度、減少死亡或生長(zhǎng)損失無(wú)疑是一條強(qiáng)有力的控制病害途徑。本研究結(jié)果顯示，茉莉酸甲酯對(duì)桉樹焦枯病菌沒有直接毒性，MeJA在植物抗病中的主要作用不是直接的抑菌作用，而是誘導(dǎo)刺激植物防御系統(tǒng)表達(dá)，以防止焦枯病菌對(duì)桉樹的侵害，且誘導(dǎo)的最佳濃度為0.1 mmol/L，最佳表達(dá)為誘導(dǎo)后第5天。更可喜的是感病種系“巨桉3號(hào)”所表現(xiàn)出的誘導(dǎo)效果比中感種系“巨尾桉廣9”更佳，這無(wú)疑給生產(chǎn)實(shí)踐帶來(lái)福音。

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