毛君杰，肖謀良，陳香碧，梁承明，董明哲，蘇以榮，李巧云，申 燕

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院,湖南 長沙 410128；2. 中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，湖南 長沙 410125； 3. 貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700)

【研究意義】我國喀斯特地貌主要分布在貴州、廣西、云南三省，面積約55萬km2[1]。該區(qū)域海拔較高、氣候溫和、日照充足、降雨量豐沛，是我國優(yōu)質(zhì)烤煙主產(chǎn)區(qū)。烤煙是我國喀斯特貧困地區(qū)最重要的經(jīng)濟作物之一[2]。近年來，采用有機生產(chǎn)方式生產(chǎn)烤煙的技術(shù)在喀斯特地區(qū)得到大力推廣，深受國內(nèi)外卷煙工業(yè)企業(yè)的青睞，其發(fā)展勢頭勢不可擋[3]。然而，喀斯特地區(qū)烤煙不同有機生產(chǎn)方式下，煙葉質(zhì)量和土壤性質(zhì)有何差異尚不清楚?！厩叭搜芯窟M展】施肥是烤煙栽培的關(guān)鍵技術(shù)之一，肥料種類、施肥用量和施肥方法對煙葉品質(zhì)和土壤性質(zhì)都具有顯著的影響[4-5]。施用適量腐殖酸肥和芝麻餅肥可提高土壤微生物總量，促進烤煙根系發(fā)育，協(xié)調(diào)煙葉化學成分，增加煙葉產(chǎn)量，從而提高烤煙產(chǎn)值[6]。施用菜籽餅和花生餅肥后土壤中細菌、放線菌、好氣性纖維分解菌和亞硝化細菌數(shù)量明顯增加[7]。我國釀酒業(yè)發(fā)展十分迅速，每年都要產(chǎn)生大量的下腳料——酒糟，除少量用作飼料外，大部分尚未得到合理利用。研究發(fā)現(xiàn)，以酒糟為原料發(fā)酵有機肥的含氮量達3 %，含磷量1 %，有機質(zhì)含量超過70 %，各項指標均符合國家標準[8]。此外，酒糟中含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸等有機養(yǎng)分，能增加土壤中水解性氮含量，提高氮肥利用率，促進煙苗早期生長發(fā)育。而針對酒糟作為有機肥施用于煙田土壤的研究尚不多?！颈狙芯壳腥朦c】目前，貴州喀斯特山區(qū)烤煙生產(chǎn)以煙草專用有機肥和農(nóng)家肥為主，其成本較高且資源日益匱乏。另一方面，貴州省白酒產(chǎn)業(yè)發(fā)達，產(chǎn)生大量的有機副產(chǎn)物——酒糟。若能合理利用這些有機廢棄物資源逐步取代煙草專用肥和農(nóng)家肥對于降低烤煙生產(chǎn)成本、實現(xiàn)喀斯特地區(qū)有機方式生產(chǎn)烤煙的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗利用喀斯特煙區(qū)現(xiàn)有有機廢棄物資源——酒糟作為烤煙有機肥源替代品種，研究適合當?shù)乜緹熒L的施用配方并探討其對烤煙主要化學成分和土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，對降低烤煙種植成本、提高其經(jīng)濟效益有重要現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于貴州省畢節(jié)市金沙縣，地處中國西南喀斯特山區(qū)，海拔1100～1400 m。金沙縣地跨東經(jīng)105°47′～106°44′，北緯27°07′～27°46′，年均氣溫在12.5～16.5 ℃，晝夜溫差大，年均降雨量為1050 mm，年日照數(shù)平均1098 h?？h域內(nèi)植煙區(qū)的土壤類型主要為黃壤、石灰土、粗骨土、紫色土和潮土。本研究供試土壤主要為黃壤，pH 6.1，土壤有機質(zhì)和全氮含量分別為30.17和1.49 g/kg。

1.2 試驗設(shè)計

于2014年3月在金沙縣桂花站開化點選擇開闊、平坦、向陽的土地一塊，土壤類型一致，面積約2000 m2，進行小區(qū)試驗。試驗區(qū)統(tǒng)一采用單行起壟蓋膜方式，共10個處理(加上對照)，每個處理小區(qū)約32.4 m2，4個重復(fù)。每個重復(fù)3行，每行種植煙苗15株，共45株。株距0.6 m，壟距1.1 m，壟底寬0.7～0.8 m，壟體土碎平整飽滿。不同處理間間距1.8 m，重復(fù)間間距2.2 m，并挖溝間隔。供試烤煙品種為云煙87。試驗以當?shù)赜袡C煙施肥模式(T1)為對照，共設(shè)置9個以酒糟配合兩種微生物肥料逐步取代農(nóng)家肥和商品有機肥的處理(T2～T10)，每處理4個重復(fù)，具體施肥量詳見表1。設(shè)置處理的原則是以當?shù)亓晳T施肥135.5～135 kgN/hm2為依據(jù)，各處理間氮肥施用量基本保持一致。試驗所用酒糟有機肥以當?shù)蒯劸茝S生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的發(fā)酵廢渣(主要成分為高粱發(fā)酵物)為原料，經(jīng)接菌(解淀粉芽孢桿菌和莫海威芽孢桿菌)、摻拌、條垛堆積與自然通風后，再進行粉碎、過篩(20目)所得。本試驗選取時科竹炭與沃土沃兩種微生物肥料進行施用。施用微生物肥料目的是促進酒糟中有機質(zhì)降解，加速養(yǎng)分釋放。其中，時科竹炭生物有機肥產(chǎn)自時科生物科技(上海)有限公司，以竹炭、竹醋液、氨基酸、腐植酸、有益微生物菌群等為主要原料。沃土沃微生物肥料產(chǎn)自焦作市宗源生態(tài)產(chǎn)業(yè)有限公司，以NX-PGPR復(fù)合微生物菌為核心(中國農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所研發(fā))，由多種營養(yǎng)菌、生物拮抗菌組成。試驗所用農(nóng)家肥中氮、磷、鉀含量分別為5.86、1.80、6.42 g/kg，商品有機肥中氮、磷、鉀含量分別為36.00、11.87、21.51 g/kg，油枯中氮、磷、鉀含量分別為54.94、26.02、11.49 g/kg。酒糟中氮、磷、鉀含量分別為21.00、0.31、1.90 g/kg。

在經(jīng)過深耕、耙平的煙地上設(shè)置試驗小區(qū)，于移植煙苗前兩周施用基肥。隨后單行起壟蓋膜，并選取壯苗移栽。小區(qū)嚴格按當?shù)赜袡C煙管理方式進行，同時做大田管理及其它生產(chǎn)有關(guān)情況的記錄。

表1 各處理肥料用量

1.3 樣品采集

于2014年7月中旬與中下旬烤煙成熟期，分別采集每個小區(qū)5株煙草的下部葉及上部葉，并將同一小區(qū)同一部位煙葉混合。每個樣品取1.50 kg，于105 ℃下殺青15 min后，60 ℃烘干至恒重，粉碎過60目篩，用于煙葉化學成分測定。每批煙葉采樣至殺青的間隔時間應(yīng)盡量一致。此外，在每個小區(qū)采用多點采樣法采集表層土壤(0～15 cm)，混勻后分為3份。第1份約50 g置于冰盒中帶回實驗室冷凍干燥后用于微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)分析；第2份約300 g帶回實驗室后過2 mm篩，用于微生物生物量測定；第3份約500 g經(jīng)自然晾干、除去植物根系、石礫后，過篩用于分析土壤基本性質(zhì)。

1.4 分析方法

1.4.1 煙葉化學成分 分別依據(jù)《中華人民共和國煙草行業(yè)標準》YC/T 159-2002、YC/T 161-2002、YC/T 160-2002、YC/T 173-2003和YC/T 162-2002的連續(xù)流動分析法測定烤煙總糖與還原糖、總氮、煙堿、鉀及氯含量。

1.4.2 土壤微生物量碳氮和基本理化指標 采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法測定土壤微生物量碳和微生物量氮[9]；其它土壤理化指標參照《土壤農(nóng)化分析》相關(guān)方法測定[10]。

1.4.3 土壤微生物群落分析 微生物總DNA提?。翰捎肧DS-GITC-PEG法提取土壤微生物總DNA[11]，用0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA片段大小，用核酸蛋白測定儀檢測DNA的濃度與質(zhì)量。實時熒光定量PCR：以細菌通用引物F984和R1378[12]和真菌通用引物NS1/Fung[13]，根據(jù)SYBR Premix ExTaq(Perfect Real Time)產(chǎn)品說明進行細菌和真菌的定量PCR擴增。構(gòu)建克隆文庫：以土壤微生物總DNA為模板，分別對細菌16S rDNA(引物為：27F和519R)[14]、真菌18 rDNA(引物為：ITS1F和ITS4)基因片段進行PCR擴增[15]?；厥漳康钠芜M行克隆，并送華大基因進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

各克隆庫中的序列輸入EMBL-EBI網(wǎng)站進行比對，根據(jù)相似性95 %歸為一個操作單元(OTU，等同于“屬”分類)，采用Estimate S Win9.1.0軟件和Excel 2010計算香農(nóng)多樣性指數(shù)、辛普森指數(shù)和均勻度指數(shù)并繪制稀疏曲線；將序列輸入Ribosomal Database Project 11.3數(shù)據(jù)庫中，按相似性為80 %分別確定綱和門的遺傳分類[16]。

采用SPSS 19.0軟件，對煙葉化學成分進行單因素方差分析(置信水平95 %，99 %)。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉化學成分

表2 不同處理上部和下部煙葉的主要化學成分含量

注：UP代表上部葉，LO代表下部葉；同列不同字母表示該指標在不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Notes：UP represents upper tobacco leaves, LO represents lower tobacco leaves; Various letters in the same column represent significant difference (P<0.05).

本研究根據(jù)袁有波等[17]結(jié)合工業(yè)企業(yè)對煙葉化學質(zhì)量的要求和畢節(jié)各區(qū)縣歷史煙葉質(zhì)量狀況制訂的評價指標體系，分析本研究不同處理煙葉化學成分(表2)。煙堿：所有處理的烤煙上部葉和下部葉煙堿平均含量分別為4.10 %、2.51 %，總體處于較高或高水平；當?shù)厥┓侍幚鞹1的上部葉和下部葉煙堿含量均處于高水平，與其相比，除優(yōu)化施肥處理T2、T6和T10的上部葉煙堿含量略有升高(P>0.05)以外，其余處理的上部葉和下部葉煙堿含量均降低(降幅0.00 %～0.60 %)，部分處理達到顯著水平(P<0.05)。總糖：所有處理的總糖處于適中或較高水平；與T1相比，所有優(yōu)化施肥處理的上部葉總糖含量均降低(降幅0.67 %～5.91 %)，其中T10達到顯著水平(P<0.05)；所有處理的下部葉總糖含量無顯著差異(P>0.05)，降低后的總糖含量更趨近于適中水平。還原糖：所有處理上部葉和下部葉還原糖平均含量分別為24.16 %和31.87 %，處于較高水平；與T1相比，優(yōu)化施肥處理上部葉還原糖均有所降低(降幅0.24 %～5.46 %，P>0.05)，其中T10達顯著水平(P<0.05)，下部葉除T3、T3和T4處理略微升高外(P>0.05)，其余處理均降低(降幅0.15 %～1.82 %)?？偟篢1的上部葉氮素含量偏低，優(yōu)化施肥后，各處理氮素含量均有上升，增加量在0.06 %～0.30 %；除T4外，下部葉全氮含量均處于適中水平(1.63 %～1.87 %)。鉀素：所有處理鉀素含量在上部葉(0.98 %～1.22 %)和下部葉(1.52 %～1.83 %)均處于低或較低水平；與T1相比，優(yōu)化施肥處理無顯著差異(P>0.05)。氯：所有處理的煙葉中氯含量均處于適中水平(0.35 %～0.51 %)。

總的來說，酒糟部分替代或完全替代農(nóng)家肥、商品有機肥時，配施微生物肥在一定程度上能降低煙葉煙堿、總糖、還原糖、氯含量，小幅度增加煙葉氮素含量，但對鉀素影響不大，使煙葉化學成分處于較適中水平，其中，T3、T5、T8和T10效果較好，T4、T7和T9效果次之，T2和T6效果欠佳，其會造成煙堿小幅升高或鉀素小幅降低。

2.2 煙田土壤養(yǎng)分

烤煙成熟期，所有處理煙田土壤基本性質(zhì)(表3)中pH無顯著差異(P>0.05)。與對照T1相比，酒糟部分替代商品有機肥并且添加微生物肥料加微生物肥料時(T2、T5和T6)，有利于土壤有機質(zhì)的積累、并提高土壤全氮、速效氮、全鉀、速效鉀、速效磷含量，利于有機肥中速效養(yǎng)分的釋放。

表3 煙草成熟期土壤基本性質(zhì)

表4 不同施肥處理下煙田土壤細菌和真菌豐度

注：同一列不同阿拉伯字母表示某指標在不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note： Various letters in the same column represent significant difference (P<0.05).

2.3 煙田土壤微生物豐度和多樣性

總體上，各處理土壤細菌(2.96×1010～4.61×1010)比真菌數(shù)量(1.04×107～3.62×107)高約3個數(shù)量級(表4)。隨著酒糟肥逐步取代商品有機肥和農(nóng)家肥，土壤中細菌和真菌數(shù)量均上升，且總體以酒糟肥完全取代商品有機肥和并配合施用沃土沃或時科竹炭微生物肥的數(shù)量最高?；谕寥乐屑毦鷶?shù)量遠大于真菌，我們僅對細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果顯示：細菌多樣性指數(shù)以優(yōu)化施肥處理(T3～T9)略高于當?shù)厥┓侍幚?T1)，其中T3的細菌多樣性略高于其余2個處理，而T5和T8顯著高于未添加微生物肥的處理。

2.4 煙田土壤細菌群落結(jié)構(gòu)

10個克隆庫共2000個克隆子被歸類為16個類群(門)，其中變形菌占19.0 %，放線菌占16.5 %，酸桿菌占14.1 %，綠彎菌占13.7 %，這四類作為優(yōu)勢類群合計占克隆庫的63.2 %(圖1)。

對四類優(yōu)勢菌分別進行具體分析。變形菌：當?shù)厥┓?T1)條件下，變形菌占19 %，與其相比，50 kg酒糟取代20 kg商品有機肥的處理(T2、T3、T4)變形菌均顯著下降；當150 kg酒糟取代200 kg農(nóng)家肥和40 kg商品有機肥并配施沃土沃微生物肥(T6)后變形菌比例顯著增加至30 %，其余2個處理(T5和T7)變化不大；當250 kg酒糟全部取代農(nóng)家肥和商品有機肥并配施沃土沃或時科竹炭微生物肥(T8和T9)的變形菌比例有一定幅度上升，未配施微生物肥的處理(T10)其比例有一定下降(圖1)；不同處理下，變形菌的四個亞門比例總體以α-變形菌所占比例最高，且不同處理之間差異較大(4 %～15 %)，β-、γ-和δ-變形菌所占克隆庫的比例，在不同處理間差異不大(數(shù)據(jù)未列出)。放線菌：當?shù)厥┓侍幚?T1)的放線菌門占10.5 %，優(yōu)化施肥處理后，該類細菌所占比例均有明顯提高(14.5 %～20 %)。酸桿菌：當?shù)厥┓侍幚?T1)的酸桿菌門占17 %，優(yōu)化施肥處理中，除150 kg酒糟取代200 kg農(nóng)家肥和40 kg商品有機肥并配施沃土沃微生物肥的處理(T5)其比例有一定升高(19.5 %)外，其余優(yōu)化施肥處理均不同程度下降(16 %～10.5 %)；酸桿菌以Gp4和Gp6 2個類群為主)。綠彎菌：當?shù)厥┓侍幚?T1)的綠彎菌占13 %，施用沃土沃微生物肥的處理T5和T8的綠彎菌比例下降外，其余處理均有一定幅度上升。

圖1 不同施肥處理下土壤細菌各類群的分布Fig.1 Distribution of bacterial phyla under different fertilization treatments

除四類優(yōu)勢類群外，克隆庫還存在擬桿菌、疣微菌、芽單胞菌等非優(yōu)勢類群，其中未知菌占克隆庫的12.8 %。

3 討 論

煙堿、總糖、還原糖、總氮、鉀、氯等化學成分的絕對含量和比例是評價烤煙品質(zhì)最主要的指標[18]。本小區(qū)試驗表明，無論是該煙區(qū)原有的施肥模式還是優(yōu)化施肥模式下，烤煙煙葉煙堿、總糖、還原糖、總氮、鉀、氯含量均處于適宜至偏低或偏高的范圍內(nèi)，即該煙區(qū)煙葉質(zhì)量總體較好。本研究采用低廉且易獲得的酒糟肥配合少量微生物肥替代價格相對高昂的煙草專用有機肥以及當?shù)厝諠u匱乏的農(nóng)家肥后，大部分處理能在一定程度上改善煙葉化學成分的比例，提高烤煙質(zhì)量?？傮w上，當酒糟部分取代煙草專用有機肥和農(nóng)家肥時，需配施少量沃土沃或時科竹炭微生物肥，而當酒糟全部取代煙草專用有機肥和農(nóng)家肥時則可以不用配施微生物肥。推測其可能的原因是：所用的酒糟肥是利用當?shù)蒯劸茝S生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的發(fā)酵廢渣(主要成分為高粱發(fā)酵物)，經(jīng)物料接菌、摻拌、條垛堆積發(fā)酵和發(fā)酵結(jié)束后再自然通風1～2個月發(fā)酵而成。該肥料中含有大量能分解酒糟有機肥的微生物，當其部分取代煙草專用有機肥和農(nóng)家肥時，還需要補充一定微生物群落，才有利于煙草專用有機肥中養(yǎng)分的釋放。該推論可以從土壤微生物多樣性指標得到證實。

一個穩(wěn)定健康的土壤生態(tài)系統(tǒng)依賴于一定的微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)。與當?shù)厥┓?T1)相比，所有優(yōu)化施肥處理(T2處理真菌除外)的細菌和真菌數(shù)量均顯著增加(P<0.05)。而土壤細菌和真菌數(shù)量并不總以施用了微生物肥料的處理最高，可能的原因是①酒糟肥、微生物肥、農(nóng)家肥以及土壤本身的微生物群落之間有拮抗作用；②施用肥料后，外源微生物在作物根際產(chǎn)生系列生物化學作用，刺激作物根系產(chǎn)生抑制微生物生長的物質(zhì)[19]。

本研究煙田土壤中細菌比真菌數(shù)量高約3個數(shù)量級，表明細菌占絕對優(yōu)勢。一般而言，變形菌是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)土壤中的優(yōu)勢細菌類群，尤其在喀斯特農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中[20]。變形菌門中包含大量維持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)功能的有益微生物，如α-變形細菌中的根瘤菌具有固氮功能，而α-變形細菌中的根瘤菌目和紅螺菌目，β-變形細菌的伯克氏菌目、紅環(huán)菌目和亞硝化單胞菌目以及γ-變形菌中的著色菌目中部分光合細菌和化能自養(yǎng)菌含有完整的RubisCO I的編碼基因，可以通過卡爾文途徑來固定二氧化碳，增加土壤碳庫[21]。放線菌屬于原核生物系統(tǒng)進化樹上高GC比例、革蘭氏陽性細菌分支類群，它不僅可以降解大量不同類型的有機化合物如有機肥，而且還能分泌各種代謝物質(zhì)如抗生素及其它拮抗物質(zhì)，可以殺滅或抑制其它微生物的生長[22]。綠彎菌，它們是一類具有綠色的色素，能通過光合作用產(chǎn)生能量的細菌，綠彎菌主要是利用3-羥基丙酸途徑來固定二氧化碳[23]。本研究當?shù)厥┓侍幚淼募毦郝湟宰冃尉退釛U菌門占優(yōu)勢，綠彎菌和放線菌門占次要優(yōu)勢地位，與其相比，優(yōu)化施肥處理的細菌群落結(jié)構(gòu)趨勢基本一致。其中，酒糟肥部分取代煙草專用有機肥和農(nóng)家肥后以變形菌或放線菌占優(yōu)勢地位；當其配施時科竹炭微生物肥后酸桿菌比例小幅上升，綠彎菌比例小幅下降；當其配施沃土沃微生物肥后變形菌門比例上升(T6處理上升幅度較大)，綠彎菌比例小幅下降。酒糟肥完全取代煙草專用有機肥和農(nóng)家肥后，土壤細菌以變形菌和放線菌門占絕對優(yōu)勢，其配施微生物肥后變形菌、放線菌比例小幅上升，綠彎菌小幅下降。因此，從優(yōu)勢細菌群落來看，優(yōu)化施肥能維持原有土壤優(yōu)勢細菌群落和多樣性，表明優(yōu)化施肥后能較好地維持煙田土壤的生態(tài)功能，并在此基礎(chǔ)上對新的施肥模式有小幅響應(yīng)(非優(yōu)勢細菌群落小幅改變)，在土壤中形成優(yōu)化的細菌群落結(jié)構(gòu)。土壤中細菌80 %以上棲息在土壤穩(wěn)定團聚體微孔中，土壤團聚體的形成是一個長期的過程，施用有機肥對土壤團聚體結(jié)構(gòu)、肥料以及其它水氣熱等物理性質(zhì)的改變也是一個長期的過程。

4 結(jié) 論

該煙區(qū)當?shù)卦惺┓誓Ｊ胶蛢?yōu)化施肥模式下，烤煙煙葉煙堿、總糖、還原糖、總氮、鉀、氯含量均處于適宜至偏低或偏高的范圍內(nèi)。大部分優(yōu)化施肥處理能在一定程度上改善煙葉化學成分的比例，提高烤煙質(zhì)量，且優(yōu)化施肥處理后，土壤微生物優(yōu)勢群落結(jié)構(gòu)和多樣性能保持穩(wěn)定，維持其原有的生態(tài)功能。這表明采用低廉且易獲得的酒糟肥配合少量微生物肥替代價格相對高昂的煙草專用有機肥以及當?shù)厝諠u匱乏的農(nóng)家肥是可行的。該煙區(qū)煙葉煙堿偏高、鉀素偏低的情況尚未徹底解決，其原因可能在于該煙區(qū)施肥量偏高，土壤后期供肥過高，有待進一步優(yōu)化該煙區(qū)施肥水平。

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