劉 振，趙 洋，楊培迪，成 楊，劉本英，李游勇，楊 陽*

(1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，國家茶樹改良中心湖南分中心，湖南 長沙 410125；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，云南 勐海 666201)

【研究意義】茶[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]屬于山茶屬(Camellia)茶組(Sect.Thea)，為多年生常綠木本植物，起源于我國云南地區(qū)，我國擁有極其豐富的茶樹資源。由于世代的異花授粉及人類的變異選擇，使茶樹種質(zhì)資源的遺傳背景復(fù)雜，變異體繁多，這給茶組植物“種”的劃分帶來了很大的困難[1-2]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，DNA序列分析為植物鑒定、分類等研究提供了更為方便快捷的方法。DNA序列分析是區(qū)分個體間遺傳差異的最直接方法，可提供基因組特異區(qū)的完全遺傳信息[3]。植物DNA序列分析不僅是傳統(tǒng)植物分類與鑒定的強有力補充，而且能使標(biāo)本鑒定過程實現(xiàn)自動化和標(biāo)準(zhǔn)化，突破了對經(jīng)驗的過度依賴，并能夠在較短時間內(nèi)建成易于利用的應(yīng)用系統(tǒng)，在物種系統(tǒng)進(jìn)化、分類和鑒定等方面展示出了強大的生命力[4-5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前DNA序列分析已在中草藥、蘋果、水稻、香蕉等作物的系統(tǒng)進(jìn)化、物種分類與鑒別等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3,6-9]，采用的DNA序列主要有cpDNA的rbcL、matK、trnH-psbA序列，rDNA的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)和mtDNA序列等。研究表明，這些序列在不同物種間或同一物種的不同分類階元上存在通用性和進(jìn)化速率的差異，因此在進(jìn)行序列分析之前，有必要對所選的序列進(jìn)行評估，找到高效可行的引物序列。目前茶樹上已有采用DNA序列進(jìn)行親緣關(guān)系研究的報道，陳春梅[10]采用3對葉綠體DNA序列進(jìn)行了山茶屬植物的親緣關(guān)系研究，研究表明其中的2對表現(xiàn)出種內(nèi)序列的高度保守性。由此可見，現(xiàn)有的DNA序列數(shù)量與質(zhì)量還遠(yuǎn)不足以進(jìn)行茶組植物的種間關(guān)系分析等研究?！颈狙芯壳腥朦c】本研究對已報道的cpDNA、rDNA ITS和mtDNA中的不同序列在茶組植物的種內(nèi)和種間進(jìn)行了比較分析，探討了序列分析在茶組植物研究中的可行性。【擬解決的關(guān)鍵問題】為茶組植物的系統(tǒng)演化和分類等研究提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

參試16份茶樹種質(zhì)資源，其中原產(chǎn)于云南的7份采自于國家茶樹種質(zhì)資源云南茶樹圃，其余資源均采自于湖南省茶葉研究所茶樹種質(zhì)資源圃，豬婆茶作為外類群。取1芽2葉新稍，液氮迅速冷凍處理，然后將其保存在-40 ℃冰箱中備用(表1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 采用試劑盒(天根生化科技有限公司，型號DP305-02)進(jìn)行DNA提取，提取方法參照試劑盒說明書。

1.2.2 引物合成 cpDNA和ITS序列引物參照高連明等[5]的引物序列，mtDNA序列引物參照鄧長娟[6]引物序列，由天根生化科技有限公司進(jìn)行引物合成。

1.2.3 PCR擴增體系 從表2可知，PCR擴增在Thermo-5020型PCR儀(Thermo Fisher Scientific. Int’l trade Co., Ltd.)上進(jìn)行，擴增產(chǎn)物通過1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 16個參試茶樹種質(zhì)資源情況

表2 不同引物PCR反應(yīng)程序

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 使用dnastar軟件(http://www.dnastar.com/)進(jìn)行序列拼接，先剪去序列兩端不可靠的堿基序列和引物序列，然后再將正反兩個引物的序列進(jìn)行比對，對序列進(jìn)行編輯后獲得正反引物序列一致的DNA序列。通過MEGA6.0軟件中(http://www.megasoftware.net/mega)的 ClustalW 功能對所選材料的序列進(jìn)行比對，適當(dāng)手工校正，去除邊緣不準(zhǔn)確的部分序列，整理以待分析，計算堿基比例和變異堿基數(shù)[11]。采用MP法(most parsimonious tree, MP)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，對分支的可靠性評價使用靴帶值(bootstrap，1000次重復(fù))分析，自展數(shù)值75 %～100 %表示強支持率，50 %～74 %表示弱支持率，< 50 %表示不支持[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物通用性分析

本研究共合成引物15對(表3)，其中cpDNA序列引物共6對，ITS序列引物3對，mtDNA序列6對。研究表明：15對引物中有9對成功測序(圖1)，3對擴增出2條目的片段(ITS5-ITS4、ITS5a-ITS4和ITS1-ITS4)，1對沒有擴增出目的片段(cox2/2-3)，2對引物測序失敗(trnH2-psbAF和nad4/3-4)。通用性最高為cpDNA序列引物，共5對引物成功擴增與測序，成功率為83.33 %；其次為mtDNA序列，共有4對成功擴增與測序，成功率為66.67 %；ITS序列區(qū)域引物的通用性較低，在茶組植物中均未擴增出單一目的片段。

2.2 不同序列特征差異

測序成功的9對引物中，有1對引物在所有資源間沒有堿基差異(ccb256)，其余8對引物中，擴增序列長度最長的為390F-1326R(859bp)，最短的為orf25(446 bp)；GC含量最低為3F-IR(32.9 %)，最高為rbcla-rev(45.2 %)，cpDNA的GC含量平均值與mtDNA的基本一致(分別為40.06 %和41.87 %)；種間變異位點最多的為rbcla-rev(24個)，最少的為nad4L/orf25 (2個)，位點變異率最高的為rbcla-rev(4.76 %)，最低為nad4L/orf25(0.37 %)，cpDNA的堿基變異率平均值(2.91 %)要遠(yuǎn)高于mtDNA(0.55 %) (表4)。

2.3 不同序列引物的位點變異

本研究對C.sinensisvar.sinensis變種內(nèi)和不同變種間的位點變異情況進(jìn)行了人工統(tǒng)計(圖2)，從表5可以看出，C.sinensisvar.sinensis變種內(nèi)共發(fā)生變異的位點有9個，占總位點數(shù)的0.19 %；不同變種間發(fā)生變異的位點有90個，占總位點數(shù)的1.85 %。變異位點中除cox3引物序列外，其余序列的堿基顛換數(shù)都多于轉(zhuǎn)換數(shù)，顛換數(shù)占變異堿基數(shù)的比例在50 %(cox3)到100 %(nad4L /orf25和orf25)之間。

圖1 390F-1326R引物的原始峰圖Fig.1 Direct sequencing peak map of primer 390F-1326R

DNA類型DNAtypes序列區(qū)域Region引物名稱Primername引物序列Primersequence(5’?3’)擴增結(jié)果AmplificationresultcpDNArbcL1F?724RF：ATGTCACCACAAACAGAAACR：TCGCATGTACCTGCAGTAGC成功擴增rbcLa＿f?rbcLa＿revF：ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCR：GTAAAATCAAGTCCACCRCG成功擴增rbcLa＿f?rbcL＿ajf634F：ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCR：GAAACGGTCTCTCCAACGCAT成功擴增matK390F?1326RF：CGATCTATTCATTCAATATTTCR：TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT成功擴增3F?IRF：CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAGR：ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC成功擴增trnH?psbAtrnH2?psbAFF：GTTATGCATGAACGTAATGCTCR：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC測序失敗rDNAITSITS5?ITS4F：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGR：TCCTCCGCTTATTGATATGC無單一目的片段ITS5a?ITS4F：CCTTATCATTTAGAGGAAGGAGR：TCCTCCGCTTATTGATATGC無單一目的片段ITS1?ITS4F：TCCGTAGGTGAAGCTGCGGR：TCCTCCGCTTATTGATATGC無單一目的片段mtDNAccb256F：GGAAGTTAGCAAAGTTAGACR：TTGTTCTTAACAGCGATGGC成功擴增cox2/2?3F：TAGRAACAGCTTCTACGACGR：GRGTTTACTATGGTCAGTGC無目的片段cox3F：CCGTAGGAGGTGTGATGTR：CTCCCCACCAATAGATAGAC成功擴增nad4/3?4F：GGAGCTTTCCAAAGAAATAGR：GCCATGTTGCACTAAGTTAC測序失敗nad4L/orf25F：CTGTYTTTTCGCACTTAGGCR：GTCCGRGGTACTATTGCTGT成功擴增orf25F：AAGACCRCCAAGCYYTCTCGR：TTGCTGCTATTCTATCTATT成功擴增

表4 DNA序列特征

2.4 參試材料的親緣關(guān)系

按照表4從1至8的引物順序?qū)y序所得到的8條序列拼接，采用MEGA 6.0軟件按照MP法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹(圖3)，可以將參試的16個茶樹品種分為3大類，其中類群Ⅰ有8個品種，包括了除汝城白毛茶之外的所有栽培品種和地方群體品種單株，類群Ⅱ僅有一份資源，為黃泥河大茶，類群Ⅲ有7份茶樹資源，包括了6個云南茶樹資源和湖南的汝城白毛茶。類群Ⅰ的自展值達(dá)到了100 %，類群Ⅲ的自展值為68 %，外類群豬婆茶沒有與其他品種完全分開。

圖2 用MEGA 軟件對齊后的部分1F-724R引物序列Fig.2 Partial sequences about 1F-724R using MEGA software

3 討 論

3.1 不同序列引物在茶組植物中的通用性

本研究采用的15對引物序列均來自報道的文獻(xiàn)，其中cpDNA序列引物共6對(5對成功擴增與測序)，ITS序列引物3對(均未獲得單一目的片段)，mtDNA序列6對(4對成功擴增與測序)，通用性最高為cpDNA序列引物，這與高連明等研究結(jié)果相似[5]。同時， 利用ITS序列對山茶屬植物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時，發(fā)現(xiàn)山茶中存在ITS假基因，應(yīng)用ITS假基因進(jìn)行山茶屬種水平的系統(tǒng)發(fā)育分析會對其真實的系統(tǒng)關(guān)系造成影響[12]，因此，在利用ITS序列進(jìn)行山茶屬植物系統(tǒng)分析時，首先應(yīng)該對獲得的序列進(jìn)行真假判別。

3.2 不同序列引物在茶組植物中的位點變異

植物DNA序列由于在不同物種、不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育研究中存在保守性的差異[13]，因此，針對某一特定的系統(tǒng)學(xué)問題選擇相應(yīng)合適的分子片段是序列分析中最為關(guān)鍵的一步。本研究中，3種不同區(qū)域的引物序列，cpDNA的堿基變異率平均值(2.91 %)要遠(yuǎn)高于mtDNA(0.55 %)，這與盧孟柱和Szmidt的研究結(jié)果相似[14]，說明線粒體基因序列的進(jìn)化速率要低于葉綠體序列的非編碼區(qū)核苷酸，因此，cpDNA的非編碼區(qū)常被用于探討種內(nèi)或種間的親緣關(guān)系[15]。在cpDNA的不同區(qū)域，matK序列區(qū)域的堿基變異率小于rbcL序列區(qū)域，matK序列兩對引物的堿基變異率分別為0.70 %和1.10 %，小于于杰[9]對柑橘及其近緣屬(2.36 %)、楊金宏與孔衛(wèi)青[16]對馬鞭草科部分植物(24 %)、王亞玲等[17]對木蘭屬植物(9.32 %)、仲軼[18]對野生鳶尾(5.39 %)的研究結(jié)果；rbcL序列的3對引物的堿基變異率分別為4.76 %、3.65 %和4.35 %，均高于于杰[9](2.56 %)和凡星等[19](2.91 %)的研究結(jié)果，而小于楊金宏與孔衛(wèi)青等[16](10 %)、仲軼[18](12.54 %)的研究結(jié)果，這一方面可能是由于試驗材料的物種及所處的分類階元不同，另一方面，類群的樣品數(shù)量和地理區(qū)域?qū)ρ芯拷Y(jié)果也有較大的影響[20]，參試材料的分類階元越高，參試樣品的數(shù)量和代表區(qū)域越多，其堿基變異率越高。值得注意的是本研究trnH-psbA序列的trnH2-psbAF引物雖然測序結(jié)果存在重疊峰，正反向測序無法拼接，但是其序列中存在著較多的堿基變異率，這與陳春梅[10]采用trnL-trnF對山茶屬 13 個種 98 份植物的研究結(jié)果相似(變異位點比率為17. 03 %)，說明trnH-psbA區(qū)域也是進(jìn)行茶組植物序列研究關(guān)注的重點。

圖中數(shù)字表示抽樣檢驗的自展百分比Numbers in the figure indicate percentage of sampling inspection圖3 基于8個序列和最大簡約法(MP)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.3 Phylogenetic tree constructed by maximum parsimony method with 8 sequences

引物名稱Primername變異來源Variationsources變異位點Variablesites390F?1326R位點Sites195629650669702760變種間AmongspeciesG/CT/GA/GG/TG/TG/A茶變種內(nèi)WithinC sinensisvar sinensisG/A3F?IR位點Sites2103161194213234668687700變種間AmongspeciesT/C無C/AC/AC/TA/CC/GC/TA/C茶變種內(nèi)WithinC sinensisvar sinensisT/Crbcla?rev位點Sites32057166200239251254294324339364393403406415447448467480481483484486變種間AmongspeciesA/T缺/GA/GA/GA/GT/GG/CG/CT/GG/CA/GT/GA/TA/T無AGA/缺A/TT/CT/GT/GA/GA/GT/G茶變種內(nèi)WithinC sinensisvar sinensisA/Grbcla?ajf634位點Sites14189262317347362387429438489506508533534535536537538539541542變種間AmongspeciesA/CA/GG/TG/TG/CG/AG/TA/GA/GT/CA/GG/TA/GA/C/G/缺C/G/TG/TT/GG/T/缺G/AC/TA/T茶變種內(nèi)WithinC sinensisvar sinensis1F?724R位點Sites37146180219231234274304319344373383386395427447460461463464466變種間AmongspeciesA/GG/AG/AT/GG/CG/CT/GC/GA/GG/TT/AT/AG/AG/A缺/AT/CG/TG/TG/AG/AT/G茶變種內(nèi)WithinC sinensisvar sinensisG/Acox3位點Sites24138474578變種間AmongspeciesA/GC/T茶變種內(nèi)WithinC sinensisvar sinensisA/CG/TC/Tnad4L/orf25位點Sites143438變種間AmongspeciesC/AA/C茶變種內(nèi)WithinC sinensisvar sinensisA/Corf25位點Sites120327變種間AmongspeciesA/CA/缺A/C茶變種內(nèi)WithinC sinensisvar sinensisA/缺缺

3.3 序列分析在茶組植物親緣關(guān)系分析中的可行性

DNA序列對物種進(jìn)行識別和鑒定已成為生物學(xué)近期研究的熱點之一[21]。本研究采用篩選8對DNA序列引物對參試的16份資源進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，研究結(jié)果可以將參試資源分為3大類，除去汝城白毛茶之外的所有栽培品種和地方群體品種單株聚為了一類，自展值達(dá)到100 %，這可能是由于參試序列在茶組植物中的特點決定的，8對引物在茶變種內(nèi)發(fā)生變異的位點僅占總位點數(shù)的0.21 %，有的序列甚至沒有位點差異，茶變種內(nèi)序列的高度保守性決定了同一變種聚在了一起。同時，部分引物在種間的變異率達(dá)4.76 %，說明所選的引物序列在茶組植物的茶變種內(nèi)存在高度保守而在變種間存在一定的差異性，這也為序列分析在茶組植物中的應(yīng)用提供了可能。但外類群豬婆茶沒有單獨分開，且云南各資源間的自展值都相對較小，說明篩選引物雖然在種間有一定的差異，但這些差異不足以完全將現(xiàn)有的資源區(qū)分開來，這與陳春梅等[10]研究結(jié)果相似。因此在進(jìn)行茶組植物等較低階元的分類研究時，還需要開發(fā)或篩選出具有較快進(jìn)化速率的片段序列。

[1]陳 亮，虞富蓮，楊亞軍，等.茶樹種質(zhì)資源與遺傳改良[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

[2]陳 亮，虞富蓮，童啟慶. 關(guān)于茶組植物分類與演化的討論[J]. 茶葉科學(xué)，2000，20(2)：89-94.

[3]朱元娣，曹敏格，許 正，等. 基于ITS和matK序列探討新疆野蘋果與中國蘋果的系統(tǒng)演化關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報，2014，41(2)：227-239.

[4]Li D Z，Liu J Q，Chen Z D，et al. Plant DNA barcoding in China[J]. Journal of Systematics and Evolution，2011,49：165-168.

[5]高連明，劉 杰，蔡 杰，等. 關(guān)于植物DNA條形碼研究技術(shù)規(guī)范[J]. 植物分類與資源學(xué)報，2012，34(6)：592-606.

[6]鄧長娟. 香蕉種質(zhì)資源種間線粒體DNA位點變異的遺傳分類[M]. 海口：海南大學(xué)，2011.

[7]栗 丹，李振堅，毛 萍，等. 基于ITS序列石斛材料的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 園藝學(xué)報，2012，39(8)：1539-1550.

[8]劉鐵燕，陳明生. 稻屬植物的基因組進(jìn)化[J]. 生物多樣性，2014，22(1)：51-65.

[9]于 杰. 柑橘及其近緣屬植物DNA條形碼研制及其物種的鑒定研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2011.

[10]陳春梅. 基于cpDNA 序列的茶樹及其近緣植物的親緣關(guān)系研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2014：17-24.

[11]Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30：2725-2729.

[12]尤 歡，周阿濤，岳亮亮，等. 山茶屬植物 ITS的擴增及其序列特征分析[J]. 植物研究，2014，34(3)：403-408.

[13]劉 巖，程須珍，王麗俠，等. 基于葉綠體DNA序列的Ceratotropis亞屬遺傳進(jìn)化研究[J]. 作物學(xué)報，2013，39(6)：979-991.

[14]盧孟柱，Szmidt A E. 松屬線粒體基因變異研究[J]. 林業(yè)科學(xué)，1999，35(4)：14-20.

[15]Shaw J，Lickey E B，Schilling E E，et al.. Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III[J]. American Journal of Botany，2007，94(3)：275-288.

[16]楊金宏，孔衛(wèi)青. 基于rbcL和matK序列探討馬鞭草科部分植物的系統(tǒng)學(xué)位置[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2013，21(2)：116-122.

[17]王亞玲，李 勇，張壽洲，等. 用matK序列分析探討木蘭屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[J]. 植物分類學(xué)報，2006，44(2)：135-147.

[18]仲 軼. 基于多基因組的鳶尾屬部分種的系統(tǒng)分類研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2010：17.

[19]凡 星，羅小梅，羅春蓮，等. 青藏高原仲彬草屬植物葉綠體rbcL序列的譜系分析[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，2(3)：271-275.

[20]Dasmahapatra K K，Mallet J. DNA barcodes: recent successes and future prospects[J]. Heredity，2006，97(4)：254-255.

[21]閆化學(xué)，于 杰. DNA 條形碼技術(shù)在植物中的研究現(xiàn)狀[J]. 植物學(xué)報，2010，45(1)：102-108.