朱欣云，丁少青，張 哲，任建峰，2，濮家飛，賈 亮，李偉明，張慶華，2

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.上海海洋大學，水產種質資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；3.密歇根州立大學漁業(yè)與野生生物系，東蘭辛，密歇根，美國 4883224）

趨化因子是一類具有趨化功能和活化作用的小分子分泌型蛋白質，由單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等多種細胞分泌產生，分子量大小通常為8～15 kDa。趨化因子在從最低等的魚類到哺乳類的整個脊椎動物中均有廣泛的表達，它們的起源甚至可以追溯到距今約5.2億年前古老的脊索動物文昌魚（Branchiotoma belcheri）［1］。趨化因子在炎癥反應、病原體感染及清除、細胞及器官發(fā)育、創(chuàng)傷修復、腫瘤形成及轉移、移植排異等方面都起著重要的作用［2］。目前已在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)近50種趨化因子，根據(jù)氨基酸序列中N端保守的半胱氨酸殘基（Cys）的數(shù)目和位置的差別，將哺乳動物中的趨化因子分為4個類型：CC型、CXC型、C型和 CX3C型［3］。2008年，PEATMAN等［4］在斑馬魚（Danio rerio）中又發(fā)現(xiàn)一種特有的CX型趨化因子，該亞類共有4個成員，到目前為止，斑馬魚中共發(fā)現(xiàn)111種趨化因子，這可能與斑馬魚的基因組中有一次額外的基因加倍有關［5-6］。趨化因子作為配體通過和細胞膜上的受體相結合而發(fā)揮相應的生物學作用［7］。

CXCL8，又稱為白細胞介素8（interleukin 8，IL-8），是常見的趨化因子，屬于C-X-C型亞家族。1987年，YOSHIMURA等［8］從細菌刺激后的人外周血單核細胞的上清液中分離純化得到第一個趨化因子CXCL8，發(fā)現(xiàn)其對中性粒細胞有趨化作用，因此被命名為粒細胞激活因子。之后的研究認為其屬于白細胞介素家族成員，在1988年倫敦學術會議上將該因子確定為中性粒細胞活性肽（Neutrophil Alkaline Phosphatase）／CXCL8。迄今為止，在許多脊椎動物中都已鑒定到CXCL8的基因，包 括 人 （Homo sapiens）［9］、雞 （Gallus gallus）［10］、爪蟾（Xenopus laevis）［11］、斑馬魚［12］和河七鰓鰻（Lampetra fluviatilis）［13］。CXCL8是促炎性細胞因子，能夠趨化中性粒細胞到達炎癥部位，促使其脫顆粒，引起呼吸暴發(fā)反應；并激活炎性細胞，如：吞噬細胞，促進急性期蛋白合成，參與炎癥反應，引起發(fā)熱。進一步研究發(fā)現(xiàn)CXCL8能夠對不同類型的細胞產生作用，促進炎癥反應進程、誘導血管的生成、促進細胞有絲分裂、調節(jié)免疫功能等，與多種炎癥反應性疾病、免疫性疾病以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關系［9］。

七鰓鰻屬圓口綱（Cyclostomata），七鰓鰻目（Petromyzoniformes），七鰓鰻科（Petromyzontidae），為無頜類脊椎動物。七鰓鰻是目前所存的最古老的無頜類脊椎動物之一，是聯(lián)系無脊椎動物與脊椎動物的重要橋梁，其免疫系統(tǒng)介于無脊椎動物（只擁有先天免疫）和硬骨魚（部分獲得性免疫）之間［14］，對其免疫系統(tǒng)的研究在理論上有著重要的進化意義。雖然目前已確定的七鰓鰻有38種，但經常以全基因組測序已經完成的海七鰓鰻（Petromyzon marinus）和日本七鰓鰻（Lethenteron japonicum）作為典型代表［15］。本研究通過PCR方法得到海七鰓鰻CXCL8的cDNA序列，成功構建了原核表達載體，并誘導表達出PmCXCL8重組蛋白，以期為進一步研究海七鰓鰻CXCL8的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

pCold I質粒、克隆載體 PMD19-T、感受態(tài)細菌DH5α和BL21購買于TaKaRa公司，感受態(tài)細菌Rosetta（DE3）和海七鰓鰻肝組織cDNA為本實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器

Profinia IMAC蛋白質純化試劑盒購買于BIO-RAD公司；Penta-His Antibody（Code：34660）抗體購買于 QIAGEN公司；HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG（Code：61-6520）抗體購買于 Invitrogen公司；超聲破碎儀器（SONICS公司，VCX150），蛋白質純化儀（BIO-RAD公司，Profinia）。

1.3 引物設計

根據(jù)已知的海七鰓鰻基因組信息（http：／／www.ensembl.org／index.html），通過 blast方法找到海七鰓鰻的CXCL8（PmCXCL8）基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列，設計出一對引物，上游引物加入NdeI酶切位點，下游引物加入HindⅢ酶切位點，引物序列如下：

CXCL8-F：5’-TCGAAGGTAGGCATATGACG ATGAACGCCAAGCT-3’

CXCL8-R：5’-GCAGGTCGACAAGCTTTCAC GGCGTGGGTTTGGGTG-3’

1.4 目的基因的擴增及分析

使用 Tks Gflex?DNA Polymerase，以海七鰓鰻肝cDNA為模板進行PCR擴增，使用25μL PCR體系：Premix 12.5μL，ddH2O 9.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA 1μL。反應條件：94℃，2 min；98℃，10 s；60℃，30 s；72℃，2 min；30個循環(huán)，72℃10 min，4℃延伸。取5μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，同時取100μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切膠回收目的片段，取10μL膠回收產物送測序。

將PCR得到的PmCXCL8基因序列在National Center of Biotechnology Information（NCBI）網站上（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST）進行序列比對，使用 SignalP 4.1 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）進行信號肽預測，使用DNAMAN 8.0進行氨基酸序列比對，使用MEGA 6.0構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 表達載體的構建

將1.4中膠回收后的目的片段和pColdI質粒使用NdeⅠ酶和HindⅢ酶進行雙酶切過夜，回收酶切后的產物，使用In-Fusion?HD Cloning Kit連接4 h，連接產物轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，提取質粒，送測序進行鑒定，原核表達載體命名為pCold-CXCL8。

1.6 重組蛋白的誘導表達及檢測

將pCold-CXCL8質粒和pColdI空載質粒分別轉入 E.coli BL21和 Rosetta（DE3）菌株中。分別挑取單克隆培養(yǎng)成種子液，然后使用5 mL LB／Amp（100μg·mL-1）培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600nm值約為0.6，15℃靜置15 min，添加100 mM IPTG 50μL（終濃度為1 mM）進行誘導，15℃繼續(xù)培養(yǎng)22 h。收集菌體后進行超聲波破碎和離心分離。取各變性后的樣品（全蛋白、上清、沉淀）8μL（0.05 OD相當），進行 SDS-PAGE電泳，使用CBB-R250染色檢測。同時進行SDSPAGE電泳及Western blot實驗，一抗使用Penta-His Antibody（1∶3000稀釋），二抗使用 HRPRabbit Anti-Mouse IgG（1∶3000稀釋），使用化學發(fā)光法顯色檢測。

1.7 重組蛋白的純化及檢測

用1.6中培養(yǎng)的400 mL帶有pCold-CXCL8載體的Rosetta（DE3）感受態(tài)菌液，誘導表達重組蛋白，對菌體超聲破碎后離心收集上清，使用Bio-Rad IMAC蛋白質純化試劑盒和Profinia蛋白質純化系統(tǒng)進行純化，純化方法參照說明書進行，純化后的蛋白以相同的條件進行SDS-PAGE電泳和Western blot分析。

2 結果與分析

2.1 海七鰓鰻CXCL8基因擴增結果及序列分析

PCR結果顯示在大約300 bp的位置擴增出單一條帶，與預期的大小一致（圖1）。測序結果表明PmCXCL8基因的ORF為309 bp，該基因編碼102個氨基酸，分子量為11.23 kDa，等電點為9.37。經預測，PmCXCL8信號肽切割位點在第23位和第24位氨基酸之間，前23個氨基酸序列屬于信號肽部分（圖2-a）。在與人（Homo sapiens，P10145.1）、猴（Macaca mulatta，P67813.1）、土撥鼠 （Marmota monax，ABY67262.1）、牛 （Bos taurus，P79255.1）、豬（Sus scrofa，P26894.1）和兔（Oryctolagus cuniculus，P19874.2）這 6種哺乳動物，雞（Gallus gallus，P08317.1）、灰雁（Anser anser，ABD49205.1） 和 鴿 子 （Columba livia，ABD49206.1） 這 3 種 鳥 類， 黑 線 鱈（Melanogrammus aeglefinus，CAD97422.2）、大西洋鱈 （Gadus morhua，ABV59376.1）、虹 鱒（Oncorhynchus mykiss，CAC83945.1）、草 魚（Ctenopharyngodon idella，AEM05971.1）、斑馬魚（Danio rerio，CCQ 71734.1）、鯉（Cyprinus carpio，BAH98111.1）、 河 豚 （Takifugu rubripes，BAD26621.1）、大 黃 魚 （Larimichthys crocea、AKM12660.1）、牙 鲆 （Paralichthys olivaceous，AAL05442. 1）、 鯰 （Ictalurus punctatus，AKQ06246.1）、 真 鯛 （Pagrus major，AHC69388.1）、條 石 鯛 （Oplegnathus fasciatus，AHC69385.1）和 青 鳉 （Oryzias latipes，XP_004065776.1）這 13種魚類及爪蟾 （Xenopus laevis，AEB96252.1）與 河 七 鰓 鰻 （Lampetra fluviatilis，CAA13114.1）的氨基酸序列進行比對后發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列上存在有與其它趨化因子相同的4個保守的半胱氨酸殘基的典型排列，分別為 C36、C38、C63與 C80位點，同時發(fā)現(xiàn)在PmCXCL8的 CXC基序前沒有 ELR（Gly-Gly-Arg）基序，而由 GGR（Gly-Gly-Arg）基序所替代（圖2-b）。與七鰓鰻、硬骨魚類和其它脊椎動物的CXCL8氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)生分析后發(fā)現(xiàn)，海七鰓鰻和河七鰓鰻的CXCL8的親緣關系最近，相似度達95%，聚為一支，并與硬骨魚類聚為一總支，同時在此總支內未與其它魚類聚為同一亞支（圖3）。

圖1 RT-PCR擴增PmCXCL8基因序列Fig.1 RT-PCR amplified fragment of Pm CXCL8

圖2 海七鰓鰻CXCL8鑒定和特征描述Fig.2 Identification and characterization of PmCXCL8

圖3 CXCL8氨基酸序列系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CXCL8 predicted sequences

圖4 pCold-CXCL8表達產物SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expressed product of pCold-CXCL8

2.2 重組蛋白的誘導表達

2.2.1 SDS-PAGE結果

SDS-PAGE電泳結果顯示，轉入重組質粒pCold-CXCL8的 E.coli BL21和 Rosetta（DE3）經IPTG誘導后，在預期位置（PmCXCL8重組蛋白預測的分子量為14.23 kDa）有1條蛋白條帶，而插入空載體的菌株誘導后未出現(xiàn)該條帶（圖4）。結果表明重組質粒pCold-CXCL8在E.coli BL21和Rosetta（DE3）中誘導表達了目的蛋白，而且，在E.coli Rosetta（DE3）中表達的條帶比 E.coli BL21深，在上清中條帶要比沉淀中深，說明目的蛋白在E.coli Rosetta（DE3）中獲得了更好的可溶性表達。

2.2.2 Western blot結果

使用Penta-His Antibody鼠單克隆抗體對重組蛋白進行Western blot鑒定，結果顯示，在預期（PmCXCL8重組蛋白預測分子量為14.23 kDa，其中融合頭大小為3 kDa，故目的蛋白的分子量為11.23 kDa）位置有單一的條帶（圖5）。說明有目的蛋白表達，在E.coli Rosetta（DE3）中條帶比E.coli BL21中要深，說明在 E.coli Rosetta（DE3）中的表達結果優(yōu)于E.coli BL21，之后利用E.coli Rosetta（DE3）作為后續(xù)蛋白表達及純化的表達系統(tǒng)。

2.3 重組蛋白的純化

經E.coli Rosetta（DE3）蛋白表達系統(tǒng)誘導表達后得到目的蛋白，使用Bio-Rad IMAC蛋白質純化試劑盒和Profinia蛋白質純化系統(tǒng)進行純化后，測得濃度為0.04 mg·mL-1，用 SDS-PAGE膠（圖6-a）和 Western blot（圖 6-b）檢測，可發(fā)現(xiàn)清晰、明顯的目的蛋白條帶，經Bio-Rad Image Lab 5.1軟件分析，目的蛋白純度大于85%。

圖5 pCold-CXCL8表達產物W estern blot分析Fig.5 W estern b lot analysis of the expressed p roduct of pCold-CXCL8

3 討論

細胞趨化因子CXCL8在哺乳動物的炎癥反應中將白細胞招募至炎癥位點的過程中起著重要作用［16］，且其趨化活性已在鯉、斑馬魚、虹鱒、牙鲆和大黃魚中利用重組蛋白得到驗證［17-20］。到目前為止，雖在河七鰓鰻中已鑒定出CXCL8基因，但其趨化功能未見報道。本研究從海七鰓鰻中發(fā)現(xiàn)并鑒定出與其它物種具有同源性的CXCL8蛋白，經分析，該蛋白擁有4個半胱氨酸位點，對于其形成特定的三級結構并發(fā)揮CXC趨化因子功能極其重要，靠近N端的2個半胱氨酸殘基之間被1個谷氨酰胺殘基隔開，這些特點均與其它物種的CXC趨化因子亞家族一致［21］。海七鰓鰻CXCL8與河七鰓鰻CXCL8氨基酸序列有95%的一致性，而且它們的分子結構中均沒有ELR基序，這一特點也與除了黑線鱈和大西洋鱈之外的大多數(shù)魚類相一致［1］。ELR基序在哺乳動物中起著招募中性粒細胞、促進血管再生的作用［22］。PmCXCL8分子中的 ELR結構的相應位置由GGR三肽基序所替代，這是否影響PmCXCL8的趨化功能還有待深入研究。

圖6 純化后SDS-PAGE電泳和W estern blot分析Fig.6 SDS-PAGE and W estern blot analysis of protein purification

系統(tǒng)發(fā)生分析后發(fā)現(xiàn)，PmCXCL8與硬骨魚類聚為一總支，除與河七鰓鰻聚為一支外，未與任何其它魚類聚為一支，這一結果與其進化地位相一致，七鰓鰻開始擁有原始的CXCL8，其與硬骨魚類CXCL8在序列上都較為相似，故有可能是從某一共同的基因進化而來。七鰓鰻作為非脊椎動物與脊椎動物之間的過度物種，一直以來被認為是活化石［14］，海七鰓鰻可以作為研究世界范圍內七鰓鰻發(fā)育、免疫和進化的良好模型，本研究結果也進一步突顯出七鰓鰻在探究高度保守的先天性免疫的進化中的重要作用。

大腸桿菌原核表達系統(tǒng)具有使用方便和成本低廉的優(yōu)點，研究水生動物基因功能時常用到該表達系統(tǒng)，2011年齊志濤等［23］研究報道了通過原核表達系統(tǒng)成功表達出非洲爪蟾干擾素-λ1基因的重組蛋白，2014年韋友傳等［24］研究報道了通過原核表達系統(tǒng)成功表達出斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）MyD88的重組蛋白。2014年劉爽等［25］研究報道了通過原核表達系統(tǒng)成功表達出日本七鰓鰻IL-17的重組蛋白。但是，有些基因仍會出現(xiàn)表達困難或者表達的蛋白以不可溶的包涵體形式存在等問題。冷休克表達載體pCold系列應用冷休克基因之一的cspA基因啟動子設計而成，可以有效表達蛋白，通過低溫誘導可明顯減慢細胞內蛋白表達速率，降低二硫鍵錯誤折疊幾率，使目的蛋白獲得更好的可溶性表達［26-27］。2008年 劉 薇［28］研 究 報 道，使 用pCold載體可以有效提高小牛凝乳酶基因在大腸桿菌中的可溶性表達。本研究結果顯示使用pColdI載體，可以在細菌培養(yǎng)的上清中發(fā)現(xiàn)PmCXCL8重組蛋白有較高的可溶性表達，為后續(xù)純化蛋白提供了很好的基礎。E.coli Rosetta（DE3）菌株含有 pRARE質粒，能夠提供 AUA，AGG，AGA、CUA、CCC和 GGA稀有密碼子的tRNA，使得該宿主菌相對于其它大腸桿菌，提高了真核細胞蛋白的表達水平［29］。2009年尹春光等［30］研究報道，使用 E.coli Rosetta（DE3）菌株，可以提高人Mx基因重組蛋白的表達，有利于改善外源蛋白由于存在稀有密碼子低效表達的問題。本研究同時使用 E.coli BL21和 Rosetta（DE3）菌株進行對比，結果發(fā)現(xiàn)在 E.coli Rosetta（DE3）菌株中目的蛋白表達量明顯高于E.coli BL21菌株組，這進一步為后續(xù)純化蛋白提供了良好的條件。

本研究首次在大腸桿菌原核表達系統(tǒng)中表達出海七鰓鰻的CXCL8蛋白，發(fā)現(xiàn)PmCXCL8與河七鰓鰻的CXCL8蛋白高度相似，相較于哺乳動物，其進化地位與硬骨魚類更為接近，為七鰓鰻的天然免疫系統(tǒng)進化研究奠定了基礎。同時使用了Bio-Rad IMAC蛋白質純化試劑盒和Profinia蛋白質純化系統(tǒng)獲得較高純度的蛋白，為今后開展PmCXCL8功能研究提供了重要工具和手段。

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