李遠，王桂霞,胡大鵬，Abidallah Eltayib，張麗雅，張祥，陳源，陳德華

（揚州大學江蘇省作物遺傳生理重點實驗室，江蘇揚州225009）

轉Bt基因棉花是利用現(xiàn)代生物技術將蘇云金桿菌的Bt基因導入棉花植株體內培育的轉基因產品[1]，是當今世界種植面積最大、分布范圍最廣的轉基因農作物之一[2-5]。轉Bt基因抗蟲棉表達的Bt蛋白，對棉鈴蟲等鱗翅目害蟲有較好殺蟲效果，能減少化學農藥的用量和使用次數，降低植棉成本，減少農藥對農田生態(tài)環(huán)境的破壞[6]，具有較好的社會、經濟和生態(tài)效益[7]。雖然Bt棉在生產上被大面積應用，但在種植過程中暴露諸多問題，主要表現(xiàn)在2個方面：即抗蟲性存在時空差異[8-11]且易受環(huán)境影響[12-15]。環(huán)境因子中溫度是最重要的影響因子之一。在棉花產量形成的關鍵時期——盛鈴期常常出現(xiàn)高溫天氣，因此研究高溫特別是晝夜變溫下高溫對棉鈴Bt殺蟲蛋白表達量的影響，對于準確預測Bt棉的抗蟲性及時防治棉鈴蟲具有重要意義。長江中下游地區(qū)棉花盛鈴期常常受高溫氣候的影響，白天的溫度高達37～40℃，研究晝夜變溫下高溫對Bt棉鈴殼殺蟲蛋白表達量及相關的氮代謝生理機制，可為高溫逆境下Bt棉的抗蟲性安全應用和合理防治棉鈴蟲提供科學依據。鈴殼作為棉鈴蟲等相關害蟲危害棉鈴的首食器官，研究其殺蟲蛋白含量在高溫下的變化是確定棉鈴抗蟲能力高低的首要依據。前人研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫能顯著降低Bt棉鈴殼中殺蟲蛋白表達量，且隨著溫度升高，下降的幅度變大[16-18]。路獻勇等[19]研究Bt棉的抗蟲性對不同晝夜溫差變化的響應機理時發(fā)現(xiàn)，白天高溫35℃，夜間低溫18℃，能顯著影響B(tài)t棉殺蟲蛋白表達量和幼蟲死亡率，且隨著脅迫時間的延長，殺蟲蛋白含量和幼蟲死亡率急劇下降。陳源等[20]研究表明在38℃以上高溫時，Bt棉棉蕾中殺蟲蛋白表達量顯著下降，且隨溫度升高，殺蟲蛋白含量下降幅度增大。周桂生等[21]研究發(fā)現(xiàn)同一高溫下，脅迫時間越長，棉鈴蟲取食后的死亡率越低。王永慧等[22]通過研究不同生育期溫濕度脅迫及脅迫解除后Bt棉殺蟲蛋白表達量的變化發(fā)現(xiàn)，溫濕度脅迫顯著抑制Bt棉殺蟲蛋白的表達。張美俊等[23]研究表明，較高溫度和適宜土壤含水量有利于Bt蛋白前期快速降解。呂春花[24]研究表明，棉蕾中Bt殺蟲蛋白含量在環(huán)境溫度達38℃以上時急劇下降。陳德華等[25]研究表明，鈴期37℃高溫脅迫24 h和48 h，會引起棉株葉片中Bt殺蟲蛋白含量顯著下降。雖然溫度對Bt棉殺蟲蛋白表達量的影響的研究較多，但都是在溫度不變的條件下進行的，而棉花的生長是在晝夜變溫的環(huán)境下。已有報道表明[26]，在高溫脅迫終止后，棉花葉片的Bt蛋白含量都有一定程度的恢復。因此本研究探討晝夜變溫條件下高溫對鈴殼Bt蛋白表達量影響能更準確反映自然環(huán)境下棉鈴抗蟲能力的變化。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2011―2012年在揚州大學江蘇省栽培生理重點實驗室進行。試驗采用盆栽種植方式進行。盆缽用土為大田土經自然風干、過篩去雜后的砂質壤土，用水沉實，含有機質1.88%，水解氮 134.7 mg·kg－1、速效磷 22.5 mg·kg－1和速效鉀81.3 mg·kg－1， 土壤 N、P、K 含量分別為 108 mg·kg－1、40.5 mg·kg－1和 82.0 mg·kg－1。 盆缽直徑 35 cm，高30 cm，每盆裝土20 kg。栽培方式為營養(yǎng)缽育苗移栽，定期澆水，保持盆中土壤含水量接近田間持水量。肥料與化控運籌按當地高產栽培技術，按等量均分，單株定量原則施用。

試驗以轉Bt基因抗蟲棉常規(guī)種泗抗1號和雜交種泗抗3號 （分別以SK-1和SK-3表示）為材料，兩年均于4月6日播種，5月17日移植于盆中。在棉花生長至盛鈴期，于人工氣候室設計39℃/27℃高溫脅迫試驗（T），持續(xù)時間分別為4 d、7 d和10 d。氣候室內相對濕度保持60%～70%。在人工氣候室達到預期溫濕度，移入棉花樣本。同時設對照（CK），溫度為32℃/25℃（白天/夜晚）。每處理3盆，重復3次，共9盆。脅迫至預定時間后，取10日齡棉鈴，液氮速凍。

1.2 測定項目

1.2.1 Bt蛋白含量的測定。用酶聯(lián)免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）進行測定，藥盒由中國農業(yè)大學提供。

1.2.2 可溶性蛋白含量的測定?？扇苄缘鞍缀繙y定應用G-250考馬斯亮藍比色法。

1.2.3 游離氨基酸含量的測定。游離氨基酸含量的測定應用抗壞血酸茚三酮染色法進行測定。

1.2.4 谷氨酸丙酮酸轉氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase,GPT）活性測定。鮮樣在Tris-HCl緩沖液中研磨離心后，提取液用賴氏比色法測定。

1.2.5 蛋白酶活性的測定。運用考馬斯亮藍法、茚三酮和抗壞血酸比色法測定可溶性蛋白質含量、游離氨基酸含量，進而計算蛋白酶和肽酶活性。

表1晝夜變溫下高溫對鈴殼Bt殺蟲蛋白表達量對影響Table 1 Effects of high alternating day and night temperature conditions on the Bt protein content in boll wall(ng·g-1)

1.3 數據處理與統(tǒng)計分析方法

用MS Excel 2016軟件進行數據的處理和作圖，用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD，α＝0.05）比較同一品種不同處理間差異的顯著性。

2 結果與分析

2.1 晝夜變溫下高溫不同持續(xù)期對Bt棉鈴殼殺蟲蛋白表達量的影響

表1表明，盛鈴期晝夜變溫條件下高溫持續(xù)脅迫至4 d時，2個品種鈴殼中Bt殺蟲蛋白表達量與各自對照相比均無明顯變化，但脅迫至7 d時，Bt殺蟲蛋白表達量均明顯降低，且隨著脅迫時間的延長，下降的幅度也越大。其中，2011年常規(guī)種SK-1在脅迫至4 d、7 d和10 d時，鈴殼中Bt殺蟲蛋白表達量分別下降了0.53%、18.44%和39.54%；雜交種SK-3分別下降了2.37%、14.82%和34.67%。2012年常規(guī)種SK-1在脅迫至4 d、7 d和10 d時，鈴殼中Bt殺蟲蛋白表達量分別下降了2.82%、19.07%和44.48%；雜交種SK-3分別下降了2.26%、15.26%和33.23%。方差分析表明，無論是常規(guī)種還是雜交種，變溫條件下高溫脅迫持續(xù)至7d時，Bt蛋白表達量顯著下降，且隨脅迫持續(xù)時間的延長，下降速率加快。品種間則表現(xiàn)為常規(guī)棉的Bt蛋白表達量下降幅度比雜交棉稍高，說明在晝夜變溫下高溫脅迫對雜交棉鈴殼的抗蟲性下降影響比常規(guī)棉小。

2.2 晝夜變溫下高溫不同持續(xù)期對Bt棉鈴殼的氮代謝生理的影響

2.2.1 對鈴殼中游離性氨基酸含量的影響。圖1表明，2個棉花品種在晝夜變溫條件下高溫脅迫至4 d時，鈴殼中游離氨基酸含量變化較小；脅迫至7 d時，游離氨基酸含量均明顯增加。隨著脅迫時長的增加，增長幅度均增加。其中，SK-1在脅迫至4 d、7 d和10 d時，游離氨基酸含量比0 d分別上升 2.59%、36.33%和 90.26%；SK-3分別上升4.30%、18.61%和59.26%。品種間表現(xiàn)為常規(guī)種鈴殼中游離氨基酸含量上升幅度比雜交種稍高。

2.2.2 對鈴殼中可溶性蛋白含量的影響。由圖2可知，晝夜變溫條件下高溫脅迫至4 d時，鈴殼中的可溶性蛋白含量下降較??；脅迫至7 d，下降速度明顯加快，下降幅度增大。SK-1在晝夜變溫持續(xù)脅迫4 d、7 d、10 d條件下，鈴殼中的可溶性蛋白含量分別下降了0.67%、24.14%和 50.39%；SK-3分別下降了0.21%、17.71%、38.47%。品種間表現(xiàn)為常規(guī)種鈴殼中的可溶性蛋白含量下降幅度高于雜交種。

由圖2可知，晝夜變溫條件下高溫脅迫至4 d時，鈴殼中的可溶性蛋白含量下降較??；脅迫至7 d，下降速度明顯加快，下降幅度增大。SK-1在晝夜變溫持續(xù)脅迫4 d、7 d、10 d條件下，鈴殼中的可溶性蛋白含量比0 d時分別下降了0.67%、24.14%和 50.39%；SK-3分別下降了 0.21%、17.71%、38.47%。品種間表現(xiàn)為常規(guī)種鈴殼中的可溶性蛋白含量下降幅度高于雜交種。

2.2.3 對鈴殼中GPT活性的影響。由圖3可知，2個不同類型品種在晝夜變溫下高溫持續(xù)脅迫至7 d時，GPT活性均明顯下降，且隨著脅迫時間的延長，下降幅度增加。其中，SK-1在脅迫至4 d、7 d和10 d時，GPT活性比0 d時分別下降了3.34%、18.06%和42.40%；SK-3比0 d時分別下降了0.50%、15.11%和36.81%。品種間表現(xiàn)為雜交種的GPT活性下降幅度稍低于常規(guī)種。

圖1晝夜變溫下高溫對棉鈴殼中游離性氨基酸含量的影響Fig.1 Effects of high alternating day and nighttemperature conditions on the free am ino acid content in boll wall

圖2晝夜變溫下高溫對棉鈴殼中可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effects of high alternating day and night temperature conditions on the soluble protein content in the boll wall

圖3晝夜變溫下高溫對棉鈴殼中GTP活性的影響Fig.3 Effects of high alternating day and night temperature conditions on GPT activity in the boll wall

2.2.4 對鈴殼中蛋白酶活性的影響。圖4表明，盛鈴期2個品種在晝夜變溫條件下高溫脅迫至4 d時，棉鈴殼中蛋白酶活性變化較小，脅迫至7 d時，蛋白酶活性明顯增加，隨著脅迫時長的增加，增長幅度均增加。常規(guī)種在變溫脅迫至4 d、7 d、10 d時，鈴殼中蛋白酶活性與0 d時相比，分別上升了0.79%、44.73%和95.11%；雜交種鈴殼中蛋白酶活性與0 d時相比，則分別上升了0.29%、27.64%和78.54%。在脅迫時長為7 d以上時，鈴殼中的蛋白酶活性增加速度明顯加快，且脅迫時間越長，增長幅度越大。雜交種SK-3鈴殼中蛋白酶活性表現(xiàn)相似。

圖4晝夜變溫下高溫對棉鈴殼中蛋白酶活性的影響Fig.4 Effects of high alternating day and night temperature conditions on protease activity in the boll wall

3 討論

3.1 晝夜變溫下高溫引起B(yǎng)t棉鈴殼殺蟲蛋白顯著下降的時間明顯推遲

關于溫度對Bt棉抗蟲性表達影響的研究有許多，但大都是以持續(xù)高溫為處理。馬愛麗等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在盛蕾期和盛鈴期36℃以上的高溫持續(xù)脅迫24 h，殺蟲蛋白表達量急劇下降。呂春花[24]等研究發(fā)現(xiàn)在高溫持續(xù)脅迫條件下Bt殺蟲蛋白含量在3 d內下降幅度較大。衡麗等[28]研究結果表明，39℃高溫持續(xù)脅迫7 d，鈴殼中Bt蛋白含量呈持續(xù)下降特征，持續(xù)脅迫3 d內尤其是在1 d內下降幅度最大。

本試驗白天高溫、夜晚溫度脅迫解除的高溫持續(xù)脅迫結果進一步表明，盛鈴期鈴殼中殺蟲蛋白表達量同樣隨著脅迫時間的延長而下降。但無論是常規(guī)種還是雜交種，在持續(xù)脅迫4 d內，鈴殼中Bt殺蟲蛋白表達量與相應對照相比均下降較小，且無顯著差異；在持續(xù)脅迫7 d以上時，鈴殼中Bt殺蟲蛋白表達量顯著下降。說明晝夜變溫下高溫持續(xù)脅迫需要更長的時間才會引起鈴殼抗蟲性的顯著降低。在棉花實際生產中，由于有晝夜溫度變化，高溫影響實際上是1種變溫脅迫，因而本試驗結果更能反映大田環(huán)境下棉鈴抗蟲性的變化。因此，Bt棉花的生產則更應注意持續(xù)7 d以上的高溫，應及時采取措施應對棉鈴蟲的防治策略。

3.2 晝夜變溫下高溫持續(xù)脅迫同樣會引起鈴殼中Bt蛋白合成下降，分解加劇，從而導致抗蟲性下降

高溫脅迫對Bt棉殺蟲蛋白表達量的影響機理已經有了較多的研究。陳德華等[29-30]認為其與氮代謝密切相關。本研究進一步表明，晝夜變溫下高溫影響B(tài)t棉鈴殼殺蟲蛋白濃度下降與氮代謝生理密切相關。在晝夜變溫下高溫脅迫7 d以上時，鈴殼中Bt蛋白含量下降的同時，游離性氨基酸含量和蛋白酶活性明顯上升，可溶性蛋白含量和GPT活性則顯著下降。相關分析進一步表明，晝夜變溫不同持續(xù)期脅迫處理下，鈴殼中可溶性白含量、GPT活性與Bt殺蟲蛋白含量之間呈極顯著的正相關關系(相關系數分別為0.954**、0.988**)；而游離氨基酸含量、蛋白酶活性與Bt殺蟲蛋白含量呈極顯著負相關關系 (相關系數分別為－0.924**、－0.775**)。因此，晝夜變溫下高溫脅迫7 d以上時會引起鈴殼中Bt蛋白的分解加強，合成減弱，從而導致Bt蛋白表達量下降。

4 結論

在晝夜變溫（39/27℃）下高溫脅迫下，鈴殼中Bt殺蟲蛋白隨脅迫時間的延長而降低，7 d后鈴殼中Bt殺蟲蛋白急劇下降，常規(guī)種泗抗1號和雜交種泗抗3號分別下降了19%左右和15%左右。在鈴殼中Bt殺蟲蛋白下降同時，游離性氨基酸含量和蛋白酶活性明顯上升，可溶性蛋白含量和GPT活性則顯著下降。這說明晝夜變溫下的高溫脅迫會導致Bt棉蛋白質合成減弱，分解加劇，從而引起抗蟲性下降。

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