王鳳春+曾滟棱

摘要 [目的]建立板栗花水提液中總黃酮含量的快速、準(zhǔn)確測定方法，為產(chǎn)品開發(fā)提供技術(shù)支持。[方法]以槲皮苷為對照品，分別采用紫外分光光度法與高效液相色譜法測定板栗花水提液中總黃酮的含量。[結(jié)果]紫外分光光度法測得總黃酮的含量為4.62 mg/mL，高效液相色譜法測得總黃酮的含量為4.64 mg/mL，2種方法所得結(jié)果基本一致。[結(jié)論]紫外分光光度法與高效液相色譜法均可用于板栗花水提液中總黃酮的準(zhǔn)確定量，但在實際生產(chǎn)應(yīng)用中完全可用紫外分光光度法替代高效液相色譜法對總黃酮的含量進行快速測定。

關(guān)鍵詞 板栗花水提液；總黃酮；紫外分光光度法；高效液相色譜法

中圖分類號 TS201 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）02-0255-03

Comparison of Quantitative Determination of Total Flavonoids in Water Extracts of Chestnut Flower by UV Spectrophotometry and HPLC

WANG Feng-chun 1 ZENG Yan-ling 2

（1 Research and Development Center of Chestnut Industry of Qianxi County，Qianxi Hebei 064300； 2 School of Chinese Materia Medica，

Beijing University of Chinese Medicine）

Abstract [Objective]To establish rapid and accurate quantitative determination method of total flavonoids in water extracts of chestnut flower and provide technical support for product development.[Methods]Taking quercitrin as the contool，UV spectrophotometry and HPLC were used to determine the content of total flavonods in water extracts of chestnut flower，respectively.[Results]The content of total flavonoids determined by UV spectrophotometry was 4.62 mg/mL，and by HPLC was 4.64 mg/mL.The content of total flavonoids obtained by the two methods were basically consistent.[Conclusion] Both UV spectrophotometry and HPLC could be used for accurate quantitative determination of total flavonoids in water extracts of chestnut flower，but in actual production，UV spectrophotometry could completely replace HPLC to determine the total flavonoids quickly.

Key words water extracts of chestnut flower；total flavonoids；UV spectrophotometry；HPLC

板栗花為殼斗科（Fagaceae）栗屬植物板栗（Castanea m-ollissima Bl.）的雄性花序，具有澀腸止瀉的功效[1]，民間用其水煎劑治久治不愈的細(xì)菌性痢疾，療效較好。已有研究表明，板栗花主要含黃酮[2]、多酚[3]、揮發(fā)油[4]、木脂素[5]及甾體[6]等多類化學(xué)成分，其中黃酮（苷）類成分的含量最高。已報道的黃酮類化合物包括栗黃酮苷A、栗黃酮苷B、槲皮素（querc-etin）、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷（quercetin-3-O-β-D-ga-lactopyranoside）、槲皮素-3-O-（6"-O-沒食子酰基）-β-D-半乳糖苷[quercetin-3-O-（6"-O-galloyl）-β-D-galactoside]、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯（quercetin-3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester）、異鼠李素（isorhamnetin）等[6]。這些黃酮類成分具有多種對人體有益的保健功能，如抗氧化、抗病毒、抗過敏、抗菌、抗發(fā)炎及血管舒張作用等[7]，可被用于藥品及保健功能食品的開發(fā)。隨著人們生活水平的提高和對自身健康重視程度的日益增強，消費者迫切需要找到一種安全、無毒并食藥兩用的物質(zhì)。而自然界廣泛分布的黃酮類化合物恰好能滿足人們的這一要求，因而研究板栗花的食用價值對食品與醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展均具有重要意義。

板栗花水提液富含具有營養(yǎng)保健功能的黃酮類物質(zhì)[8]，對其進行合理利用，如研制保健型植物提取飲料[9]，既具有可觀的經(jīng)濟效益，又可解決板栗花疏雄后雄花資源浪費的問題。有效物質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)的制定是保證功能食品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，而目前尚無對板栗花水提液中黃酮含量測定方法的研究報道。本研究以槲皮苷為對照品，對紫外分光光度法與高效液相色譜法進行比較，發(fā)現(xiàn)二者均可用于板栗花水提液中總黃酮含量的準(zhǔn)確測定，而采用紫外分光光度法測定更為簡便和快捷。該結(jié)果可為板栗花水提液的產(chǎn)品開發(fā)提供方法指導(dǎo)和數(shù)據(jù)支持。endprint

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器。U-3010型紫外-可見分光光度計（日本Hitachi）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent）；Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm，美國Agilent）。

1.1.2 材料與試劑。板栗花水提液（遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心，批號201706）。提取方法取新鮮板栗花適量置揮發(fā)油提取器中，加純水（料液比為1∶1）混合浸泡后，在0.1 MPa的蒸汽壓力下加熱，當(dāng)罐內(nèi)溫度達到110 ℃時，蒸汽壓力控制在0.1 MPa，持續(xù)循環(huán)蒸餾3 h，罐內(nèi)下層液體即為板栗花水提液樣品。

槲皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院）；色譜級甲醇（美國Sigma-Aldrich），色譜級乙腈（美國Sigma-Aldrich），色譜級甲酸（美國Sigma-Aldrich）；去離子水由Millipore-Q水純化系統(tǒng)（美國Millipore）制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫外分光光度法測定總黃酮的含量。

（1）對照品溶液的配制。稱取槲皮苷對照品12.30 mg，用適量50%甲醇（水溶液，下同）溶解后，完全轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，再加50%甲醇定容至刻度，搖勻，制得1.230 mg/mL對照品儲備液，備用。準(zhǔn)確量取對照品儲備液5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，制成0.246 mg/mL對照品溶液。

（2）供試品溶液的制備。移取板栗花水提液樣品2.5 mL，過濾后置于500 mL容量瓶中，先加入純甲醇2.5 mL，再加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

（3）檢測波長的選擇。取對照品溶液1.0 mL，加入50%甲醇稀釋9倍后，以50%甲醇為參比溶液，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描。再取供試品溶液適量，同法進行光譜掃描，以確定檢測波長。

（4）線性關(guān)系考察。分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL對照品溶液，置于15 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長下測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以吸光度（y）對質(zhì)量濃度（x，μg/mL）進行線性回歸，進行線性關(guān)系考察。

（5）精密度和穩(wěn)定性考察。取對照品溶液1.0 mL，加入50%甲醇稀釋9倍后，以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長下測定吸光度，重復(fù)6次。計算得RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。取供試品溶液適量，以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長下分別在0、20、40、60、80、100、120 min時測定吸光度，對精密度和穩(wěn)定性進行考察。

（6）重復(fù)性考察。取6份供試品溶液，以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長下測定吸光度，進行重復(fù)性考察。

（7）加樣回收率考察。取6份1.0 mL 23.12 μg/mL供試品溶液，分別準(zhǔn)確加入1.0、1.0、1.5、1.5、2.0、2.0 mL稀釋14倍的對照品溶液（16.4 μg/mL），以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長下測定吸光度并計算總黃酮量，進行加樣回收率考察。

（8）樣品測定。準(zhǔn)確移取適量供試品溶液，以50%甲醇為參比溶液，在255 nm波長下測定吸光度，重復(fù)3次。

1.2.2 高效液相色譜法測定總黃酮的含量。

（1）色譜條件。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；流動相為乙腈-水（水相含0.1%甲酸），梯度洗脫程序為0～10 min，乙腈20%～80%；流速1.0 mL/min；紫外檢測波長255 nm。

（2）對照品溶液的制備。準(zhǔn)確量取1.230 mg/mL對照品儲備液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，制成0.246 mg/mL對照品溶液。取對照品溶液0.5 mL，加入50%甲醇稀釋9倍，過濾后在上述條件下進行HPLC分析。

（3）供試品溶液的制備。移取板栗花水提液樣品2.5 mL，過濾后置于50 mL容量瓶中，先加入2.5 mL純甲醇，再加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。過濾后在上述條件下進行HPLC分析。

（4）線性關(guān)系考察。分別取0.12、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL對照品溶液，置于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述條件進行色譜分析，記錄峰面積，進行線性關(guān)系考察。

（5）精密度和穩(wěn)定性考察。取對照品溶液1.0 mL，加入50%甲醇稀釋9倍后，在上述條件下進行色譜分析，記錄峰面積，重復(fù)6次。取適量供試品溶液，在上述條件下分別在0、20、40、60、80、100、120 min時進行色譜分析，記錄峰面積，進行精密度和穩(wěn)定性考察。

（6）重復(fù)性考察。取6份供試品溶液，在上述條件下進行色譜分析，記錄峰面積，進行重復(fù)性考察。

（7）加樣回收率考察。取6份1.0 mL 231.50 μg/mL供試品溶液，分別準(zhǔn)確加入1.0、1.0、1.5、1.5、2.0、2.0 mL稀釋0.5倍的對照品溶液（164.00 μg/mL），在上述條件下進行色譜分析，記錄峰面積，進行加樣回收率考察。

（8）樣品測定。準(zhǔn)確移取適量供試品溶液，在上述條件下進行色譜分析，重復(fù)3次，記錄各色譜峰的峰面積。分別取平均值，代入回歸方程，計算得供試品溶液中總黃酮的含量。

2 結(jié)果與分析endprint

2.1 紫外分光光度法測定總黃酮含量的結(jié)果

2.1.1 檢測波長的選擇。對照品溶液與供試品溶液在255 nm附近均有最大吸收（圖1），故選擇255 nm為檢測波長。

2.1.2 線性關(guān)系考察。以吸光度（y）對質(zhì)量濃度（x，μg/mL）進行線性回歸，回歸方程為y=0.024 1x-0.013 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。結(jié)果表明，在8.20～41.00 μg/mL范圍內(nèi)槲皮苷的吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度和穩(wěn)定性考察。根據(jù)測定的對照品溶液吸光度，計算得RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。根據(jù)測定的供試品溶液吸光度，計算得RSD為0.46%，表明樣品的時間穩(wěn)定性良好，可進行紫外測定。

2.1.4 重復(fù)性考察。根據(jù)測得的供試品溶液吸光度，計算得RSD為0.51%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.1.5 加樣回收率考察。在255 nm波長下測定的吸光度并計算總黃酮量的結(jié)果見表1。計算得平均回收率為100.43%，RSD為3.51%，表明該測定方法合理。

2.1.6 樣品測定。3次重復(fù)測得樣品吸光度分別為0.544、0.542、0.545。取平均值代入回歸方程，計算得供試品溶液中總黃酮的含量為23.10 μg/mL，則板栗花水提液中總黃酮的含量為4.62 mg/mL。

2.2 高效液相色譜法測定總黃酮含量的結(jié)果

2.2.1 HPLC分析色譜圖。對照品溶液進行HPLC分析所得色譜圖見圖2，供試品溶液進行HPLC分析所得色譜圖見圖3。

2.2.2 線性關(guān)系考察。對照品溶液以色譜分析峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x，μg/mL）進行線性回歸，回歸方程為y=15.196x-12.037，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5。結(jié)果表明，在2.95～98.40 μg/mL范圍內(nèi)槲皮苷的色譜峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度和穩(wěn)定性考察。對照品溶液峰面積RSD為0.15%，表明儀器精密度良好。供試品溶液峰面積RSD為0.23%，表明樣品的時間穩(wěn)定性良好，可進行色譜測定。

2.2.4 重復(fù)性考察。計算得6份供試品溶液峰面積RSD為0.22%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.5 加樣回收率考察。6份已知濃度的供試品溶液加入稀釋的對照品溶液進行色譜分析，記錄峰面積，結(jié)果見表2。計算得平均回收率為99.95%，RSD為1.05%，表明該測定方法合理。

2.2.6 樣品測定。計算得供試品溶液中總黃酮的含量為231.87 μg/mL（表3），則板栗花水提液中總黃酮的含量為4.64 mg/mL。

3 結(jié)論與討論

測定植物提取液中總黃酮含量的常用方法有紫外分光光度法和高效液相色譜法[10]，兩者各有所長[11]。紫外分光光度法是測定總黃酮最經(jīng)典的方法，有著操作簡單、靈敏度高等優(yōu)點，但該方法特征性不強，不同成分的紫外響應(yīng)差異較大，且對照品的選擇對試驗結(jié)果有著很大影響，因而普遍認(rèn)為紫外分光光度法不能準(zhǔn)確測定總黃酮的含量。高效液相色譜法的準(zhǔn)確性、精密度和重復(fù)性通常均高于紫外分光光度法，但因為植物提取液成分復(fù)雜，色譜分離條件較難確定，且將該法用于定量分析時需要較多的對照品，所以對高效液相色譜法的接受程度不高。

板栗花黃酮具有其特殊性，前期研究中分析板栗花水提液的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)槲皮素及其苷（酯）類成分的含量較高。因此，本研究選擇在水相中溶解性較好的槲皮苷作為對照品，采用紫外分光光度法和高效液相色譜法對板栗花水提液中的總黃酮進行定量測定，在方法上具有合理性。紫外分光光度法測得板栗花水提液中總黃酮的含量以槲皮苷計為4.62 mg/mL，高效液相色譜法測得板栗花水提液中總黃酮的含量以槲皮苷計為4.64 mg/mL，2種方法所得結(jié)果基本一致，重復(fù)性高，均能較客觀地反映板栗花水提液中總黃酮的含量。另外，本研究結(jié)果也說明在實際生產(chǎn)應(yīng)用中完全可用紫外分光光度法替代高效液相色譜法，對板栗花水提液中總黃酮的含量進行快速測定。

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