范 煜，王鑫寧，張 強，蔣立新，吳良如，陳 穎，何經(jīng)晟，肖竹錢，葛 青，毛建衛(wèi)，胡林福

（1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學與生物加工技術重點實驗室 浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江 杭州310023；2.國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，浙江 杭州310012；3.浙江圣氏生物科技有限公司，浙江 湖州313399）

竹子是禾本科竹亞科多年常綠植物，為現(xiàn)今世界上最具有利用價值的植物類型之一。截止目前，全世界記錄在冊的約有70屬1 200多種竹子，廣泛分布于東南亞、印度、南美等地［1］。中國有“竹子王國”之稱，尤其是在江浙地區(qū)，竹種類繁多，適宜的氣候為竹的生長提供了優(yōu)異的生長環(huán)境。浙江地區(qū)尤以毛竹種植面積為最，僅安吉一縣毛竹林就達5.6萬hm2，是當?shù)刈钪匾慕?jīng)濟林。竹子不同部位均有較高的食用、藥用及商用價值［2］，以竹葉、竹鞭根、竹衣、竹茹、竹瀝、竹棒、竹稈、竹黃、竹膏和竹筍等為原料開發(fā)的產(chǎn)品廣泛應用于食品、醫(yī)藥、建筑、手工業(yè)和造紙業(yè)等領域［3－4］。

竹類資源的研究十分活躍，開發(fā)利用竹葉資源，提取竹葉中有效生物活性物組分，已成為人們研究的重點之一［5－9］。據(jù)報道，竹葉提取物中含有多酚、黃酮、多糖、蛋白質及氨基酸等與人體生命活動有關的活性物，竹葉提取物具有廣泛的藥用價值［10－11］。隨著中國人口增加，食品資源逐步趨于緊張，功能性植物蛋白質資源更是貧乏。將大量廉價的竹葉蛋白質資源轉化為優(yōu)質蛋白質以及功能性保健品，具有重要的社會和經(jīng)濟意義［12］。

竹葉中含有較多竹葉蛋白，毛燕等［13］對毛竹的化學成分進行了初步分析，毛竹葉蛋白質含量在所測定的9種竹葉中僅次于最高的白哺雞竹，達到15.38%，陳志印等［14］采用微波輔助提取優(yōu)化了早竹竹葉蛋白質提取工藝，提取得率為8.07%，毛竹葉蛋白總體含量相對較高，具備較高的開發(fā)利用價值。但目前的研究多以凱氏定氮法為檢測標準，以含氮量為檢測指標，該方法操作過程中試樣消化程度、催化劑用量、消化液轉移、接收瓶處理等因素都會影響蛋白質含量的測定，結果存在較大誤差［15］。該研究采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，其原理為考馬斯亮藍染液與蛋白質結合并在595 nm處得到最大吸收，較之凱氏定氮法等方法靈敏度更高。由于蛋白質在緩沖鹽溶液中擁有更大的溶解度，為提高竹葉蛋白質得率，研究采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）代替?zhèn)鹘y(tǒng)水提。通過單因素試驗、響應面試驗優(yōu)化竹葉蛋白質的提取工藝，提高竹葉蛋白質實際得率，為竹葉蛋白質的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一年生風干后毛竹竹葉由浙江圣氏生物科技有限公司提供；考馬斯亮藍，甲醇，無水乙醇等均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 主要儀器

RHP-600型高速多功能粉碎機（浙江榮浩工貿有限公司）；KQ-500E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MB45型水分測定儀（美國奧豪斯儀器有限公司）；UV 5500PC型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 毛竹葉原料含水率與總蛋白含量的測定 取1.5 g烘干后竹葉，通過MB45型水分測定儀，測定其含水率。

1.3.2 竹葉蛋白質的提取 取適量竹葉，經(jīng)過高速粉碎機粉碎，過60目篩。將竹葉粉放入超聲波提取裝置中，按所設定的提取溫度、時間、超聲功率、料液比以及提取次數(shù)，加入適量的提取液進行超聲提取。浸提結束后減壓抽濾，收集濾液，測定蛋白質含量。

1.3.3 蛋白質含量及標準曲線的測定 參考考馬斯亮藍法，測定竹葉粉中水溶性蛋白質含量［14－15］。

1.4 試驗設計

1.4.1 提取液的篩選 分別以去離子水、0.5 mol·L－1NaCl溶液、pH為8的Tris-HCl溶液、0.1 mol·L－1的PBS（pH＝7.4）為溶劑，液料比1∶20，于40℃水浴條件下提取竹葉蛋白質，提取時間60 min，以蛋白質得率為指標進行工藝參數(shù)優(yōu)化。

1.4.2 提取竹葉蛋白質的單因素實驗 根據(jù)提取液篩選結果，選用PBS緩沖溶液作為蛋白質提取的溶劑。羅秋水，劉海飛等［16－17］研究發(fā)現(xiàn)在0～120 W 范圍內蛋白質提取得率隨著超聲波發(fā)射功率增大而增大，根據(jù)KQ-500E型超聲波發(fā)生器可發(fā)射超聲波功率范圍（0～100 W），綜上所述，選擇超聲功率為100 W。實驗分別對提取時間、溫度、液料比、次數(shù)和pH值這5個影響蛋白質提取效果的因素進行單因素考察。實驗設定pH為7，液料比1∶20，提取溫度40℃，提取時間60 min，提取1次、2次、3次、4次、5次；固定pH 7，液料比20，提取溫度25℃，提取2次，提取時間采用10、20、30、40、50、60、90和120 min；固定pH 7，液料比20，提取時間90 min，提取2次，提取溫度采用10、20、30、40、50℃（蛋白質在50℃以上易變性，所以最高溫度設定在50℃）；固定pH 7，提取時間90 min，提取溫度40℃，提取2次，液料比10、15、20、25、30；固定液料比20，提取溫度40℃，提取時間90 min，提取2次，提取pH采用5、6、7、8、9，分別進行單因素實驗。

1.4.3 響應面法提取竹葉蛋白質的工藝研究 通過分析單因素實驗結果確定了提取時間、溫度、液料比、pH 4個顯著因素，使用Design-Expert 8.0軟件設計響應面試驗，試驗因素與試驗水平見表1［18］。

表1 Box-Behnken實驗設計因素與水平值Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.4.4 數(shù)據(jù)處理方法 采用Orgin和Design-Expert 8.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)的圖表和數(shù)據(jù)處理與分析。使用Box-Behnken方法對提取工藝進行優(yōu)化。

2 結果與討論

2.1 毛竹葉含水率及竹葉總蛋白含量

通過MB45型水分測定儀，測定得到干燥毛竹葉中含水率為9.48%，RSD＝0.38%。

2.2 蛋白質標準曲線的制作

試驗以牛血清蛋白標準品作為對照，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。以吸光度A為縱坐標，標準液取樣量（mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得到方程y＝0．1433x＋0．00615。R2＝0．999 55。

2.3 優(yōu)化提取液選擇

分別以去離子水、0.5 mol·L－1NaCl溶液、pH為8.0的Tris-HCl溶液、0.1 mol·L－1的PBS（pH＝7.4）為溶劑對竹葉蛋白質進行提取，結果如圖2所示。根據(jù)提取率可知，0.1 mol·L－1PBS緩沖液（pH＝7）提取得到的提取液中蛋白質含量最高，以其為最佳提取液，進行下一步實驗。

2.4 竹葉蛋白質提取的單因素實驗結果分析

2.4.1 提取次數(shù)的影響 提取次數(shù)對竹葉蛋白質提取得率的影響如圖3所示。由圖3可知，提取次數(shù)小于等于2時，隨著提取次數(shù)增加，蛋白質得率急劇增加；其后隨著提取次數(shù)進一步增加，蛋白質得率緩慢增加。由于隨著提取次數(shù)增加，原料中蛋白質含量降低，導致蛋白質得率增加的幅度降低。提取次數(shù)增加會加大生產(chǎn)成本。因此，綜合各方面因素考慮，最佳提取次數(shù)為2次。

2.4.2 提取時間的影響 提取時間對竹葉蛋白質得率的影響如圖4所示。由圖4可知，隨著提取時間的增加，蛋白質得率逐漸上升；提取時間超過60 min后，曲線趨于平緩。這可能是因為蛋白質在緩沖溶液中溶解速度較快，水溶性蛋白質幾乎全部溶出，繼續(xù)延長提取時間對其溶解量無明顯影響，只能增加其分子熱運動的程度，所以最佳提取時間為60 min。

圖1 蛋白質標準曲線Fig.1 Protein standard curve

圖2 不同提取液提取效果Fig.2 Effects of various extract solvents on the extraction rate of protein

圖3 提取次數(shù)對竹葉蛋白質提取得率的影響Fig.3 Effects of extraction times on extraction rate of bamboo leaf protein

圖4 提取時間對竹葉蛋白質提取得率的影響Fig.4 Effects of extraction duration on extraction rate of bamboo leaf protein

2.4.3 提取溫度的影響 提取溫度對竹葉蛋白質得率的影響如圖5所示。由圖5可知，當提取溫度在10～50℃時，隨著提取溫度的升高，蛋白質得率逐漸上升。在10～50℃時，隨著超聲時間增加，蛋白質整體能量增大，蛋白質分子勢能不變，只能增加動能，此時蛋白質分子熱運動相對劇烈，增加蛋白質的溶出［19］，但由于溫度超過50℃蛋白質容易變性失活。因此，選擇最佳提取溫度為50℃。

2.4.4 液料比的影響 液料比對竹葉蛋白質得率的影響如圖6所示。由圖6可知，當液料比在10～20 mL·g－1時，蛋白質得率急劇增加；但是當液料比超過20 mL·g－1后，蛋白質得率增加的幅度不大。這是由于當液料比過低時蛋白質溶出一部分，提取液中蛋白質濃度升高導致濃度差降低而影響蛋白質的溶出。當液料比增大后，提取液中蛋白質濃度較低，不再影響蛋白質的溶出，所以在20～30 mL·g－1，蛋白質得率基本不變。因此最佳液料比為20 mL·g－1。

圖5 提取溫度對竹葉蛋白質提取得率的影響Fig.5 Effects of extraction temperature on extraction rate of bamboo leaf protein

圖6 液料比對竹葉蛋白質提取得率的影響Fig.6 Effects of extract-substrate ratio on extraction rate of bamboo leaf protein

2.4.5 提取pH的影響 提取液pH對竹葉蛋白質得率的影響如圖7所示。由圖7可知，當溶液pH為5～6時，蛋白質得率緩慢上升，pH為6～7時蛋白質得率急劇上升達到最大值為7.95%。但隨著溶液pH進一步升高，蛋白質得率反而降低?？赡艿脑蚴侵袢~蛋白質在pH＝7時蛋白質發(fā)生了酸式解離，使其因為蛋白質分子之間的庫侖力作用而相互排斥，增加蛋白質分子之間的距離，使蛋白質分子之間分散并被水分子包圍，進而增加其水溶性。隨著pH的進一步增加，溶液pH達到竹葉蛋白質分子的等電點，蛋白質分子的外部不再帶有負電荷，相鄰蛋白質分子之間由于沒有靜電排斥力而產(chǎn)生團聚現(xiàn)象，導致蛋白質溶出降低。所以最佳pH為7。

圖7 提取液p H對竹葉蛋白質提取得率的影響Fig.7 Effects of pH on extraction rate of bamboo leaf protein

2.5 Box-Benhnken試驗結果

以單因素實驗結果確定了提取時間、溫度、液料比、pH 4個因素為顯著因素，以Design-Expert 8.0軟件進行Box-Benhnken試驗設計，試驗結果見表2。

如表3所示，通過Design-Expert 8.0對Box-behnken試驗結果進行了分析，通過二次四元回歸擬合，得到以下編碼方程：

Y＝7.40－0.064A－0.10B－0.27C－0.21D＋0.18AB－0.052AC＋0.060AD－0.16BC＋0.26BD＋0.055CD－0.44A2－0.068B2－0.82C2－0.36D2

得到實際因素的回歸方程：

Y＝－4.23167＋0.20267A－0.70917B＋0.18997C＋0.23417D＋0.018AB＋0.00120AD－0.00517BC＋0.0520BD－0.00437A2－0.0679B2－0.0144D2

通過軟件對模型進行了方差分析。結果如表3所示，該模型的P值小于0.01，即回歸模型與實際測量值擬合程度很高。顯著性影響因素包括B、C、D、AB、BD、A2、C2、D2（P＜0.05），而A、AC、AD、BC、B24個因素均不顯著（P＞0.05）。如表3所示，失擬項也較為顯著（P值為0.036），說明回歸模型與實際測量值能較好的擬合?；貧w模型的絕對系數(shù)R2＝95.28%，說明回歸模型與實際測量值具有較高相關性，可以用此回歸方程對不同條件下提取竹葉蛋白質的得率進行預測［18－19］。

各因素的F值大小可以反映試驗因素對竹葉蛋白質得率的影響，F(xiàn)值越大，表明其對蛋白質得率的影響越大［20］。由表3可知，F(xiàn)（A）＝1.90，F(xiàn)（B）＝5.08，F(xiàn)（C）＝32.57，F(xiàn)（D）＝20.01。且F（C）＞F（D）＞F（B）＞F（A），即各因素對竹葉蛋白質得率的影響順序為提取時間＞提取溫度＞提取pH＞液料比。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Tab.2 Box-Benhnken design and experimental results

實際因素的回歸方程中各影響因素系數(shù)的大小反映其對竹葉蛋白質提取得率的影響程度，系數(shù)的正負反映影響的方向［21］。由于方程的二次項系數(shù)有負值，代表3D圖形拋物面開口向下，具有極大值，因此可以進行優(yōu)化分析［22］。

表3 Box-Behnken試驗結果方差分析Tab.3 ANOVA results of Box-Behnken experiment

利用Design Expert軟件做不同因素間響應面分析圖與等高線圖。結果與分析見圖8所示。

圖8A－D反映各因素對竹葉蛋白質得率的影響。由圖8－A可知，在液料比22～26 mL·g－1、pH 6～7范圍內，竹葉蛋白質得率響應值可達到最佳區(qū)域，且得率隨著溫度及pH的增加呈現(xiàn)增加趨勢。圖8－B顯示竹葉蛋白質得率隨著時間的延長而呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，但是幅度不大，可能原因是超聲時間過長，部分蛋白質已變性。由圖8－C可知，在提取液料比22～26 mL·g－1、提取溫度35～45℃范圍內，竹葉蛋白質得率響應值可達到最佳區(qū)域，且得率隨著溫度的增加呈現(xiàn)增加趨勢。由圖8－D可知，在提取溫度30～40℃、提取pH 6～7范圍內，竹葉蛋白質得率響應值可達到最佳區(qū)域，且得率隨著溫度及pH的增加呈現(xiàn)增加趨勢。從以上4個圖可知，從蛋白質得率分析，提取溫度和提取時間的圖形比較陡峭，說明這2個因素交互作用顯著。結合以上4個響應面圖形，竹葉蛋白質得率的最佳取值范圍為提取溫度30～40℃、pH 6～7、液固比22～26 mL·g－1、提取時間80～100 min。通過Design-Expert 8.0.6軟件，計算得到蛋白質得率達到最大響應值時各因素的取值，即液料比23.39 mL·g－1、pH 6、提取溫度33.17℃、提取時間87.60 min、提取2次，該條件下蛋白質理論值為7.64%。

在修正后的最優(yōu)條件0.1 mol·L－1PBS緩沖溶液、液料比23.39 mL·g－1、pH 6、提取溫度33.17℃、提取時間87.60 min、提取2次，該預測條件下竹葉蛋白質得率為7.64%。該條件下進行3次實驗，測得竹葉中蛋白質平均含量為7.49%，比未優(yōu)化前增長了24.83%，為提取竹葉蛋白質提供了較好的技術支撐。

圖8 以竹葉蛋白質得率為指標的響應面圖Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on the yield of bamboo leaf protein

3 結論與展望

利用試驗模型進行響應面分析，對實驗因素及其相互作用進行探討，各因素對竹葉蛋白質得率的影響順序為提取時間＞提取溫度＞提取pH＞液料比。優(yōu)化提取竹葉蛋白質的最佳提取工藝條件為：提取2次，pH 6，33.17℃，87.60 min，23.39 mL·g－1，該預測條件下竹葉蛋白質得率為7.64%。該條件下進行3次驗證實驗，測得竹葉中蛋白質含量為7.49%，RSD＝3.68%，提取率為48.0%，。測得的竹葉蛋白質含量與理論值較為接近，表明數(shù)學模型對優(yōu)化竹葉蛋白質提取工藝是可行的。由于提取得到的蛋白質溶液中含有較多磷酸鹽，本研究課題下一步將以最優(yōu)工藝條件為基礎，通過透析、分子篩層析柱等除鹽手段，對提取得到的竹葉蛋白質竹葉蛋白質進行分離純化，及其結構鑒定與活性測定，為竹葉資源的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。