侍孝紅

南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)宿遷市人民醫(yī)院病理科，江蘇宿遷 223800

胃癌屬于消化系統(tǒng)惡性腫瘤，大部分患者就診時(shí)已發(fā)展為中晚期，整體生活質(zhì)量差且生存時(shí)間較短，死亡率占癌癥死亡的第四位。胃癌的致癌作用為一個(gè)復(fù)雜的過程，有致癌基因的激活、抑癌基本的失活等多步驟、多基因參與[1-2]。免疫逃逸在腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展過程中起到重要作用，腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的無反應(yīng)性和誘導(dǎo)凋亡為其主要機(jī)制。PD-1和PD-L1蛋白是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的抑制性通路，其對(duì)調(diào)節(jié)生理性免疫應(yīng)答的幅度、持續(xù)時(shí)間以及維持免疫耐受發(fā)揮重要作用，效防止免疫應(yīng)答破壞、損傷正常組織[3-4]。該研究選擇2014年6月—2018年8月在該院行胃癌根治術(shù)的胃癌患者的石蠟標(biāo)本66例與腫瘤組織＞5 cm的癌旁組織60例，旨在分析PD-1和PD-L1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。具體信息如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇在該院行胃癌根治術(shù)的胃癌患者的石蠟標(biāo)本66例為觀察組，并隨機(jī)選取腫瘤組織＞5 cm的癌旁組織60例為對(duì)照組。66例患者中男49例，女17例；年齡25～84歲；平均年齡（58.67±2.34）歲。入組患者或家屬均簽署知情同意書。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

對(duì)PD-1和PD-L1蛋白表達(dá)采用免疫組織化學(xué)PV-6000二步法進(jìn)行檢測，嚴(yán)格參照試劑盒說明書實(shí)施操作。將標(biāo)本蠟塊連續(xù)切為4 μm厚度的切片，脫蠟、水化后，加入3%過氧化氫溶液，室溫下作用10 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗5 min，共3遍。完成后，將檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）置入，加熱 20 min（微波爐），修復(fù)抗原，冷卻至室溫溫度。PBS液沖洗5 min，共3遍。將兔抗人PD-L1多克隆抗體（1：200 稀釋鼠）與鼠抗人 PD-1 單克隆抗體（1：200稀釋）滴入，4℃孵育過夜。PBS液沖洗5 min，共3遍。分別將50 μL二抗滴加在每張切片上，室溫下孵育20 min。PBS液沖洗5 min，共3遍。在每張切片上滴加100 μL DAB顯色劑（新鮮配置），閉光顯色于室溫下。光學(xué)顯微鏡下控制顯色時(shí)間，5 min后使用蒸餾水將切片沖洗干凈，使顯色終止。加蘇木精復(fù)染1 min，自來水沖洗返藍(lán)，經(jīng)梯度乙醇對(duì)切片脫水，完成后行10 min二甲苯透明，中性樹膠封固。

表1 PD-1和PD-L1在胃癌組織中的表達(dá)比較[n（%）]

1.3 結(jié)果判定

PD-1和PD-L1以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜有黃-棕褐色顆粒出現(xiàn)為陽性顯色。PD-L1表達(dá)使用染色強(qiáng)度、半定量積分法結(jié)合陽性細(xì)胞百分比評(píng)估。對(duì)切片整個(gè)視野在低倍鏡下觀察，在腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)上各選擇5個(gè)×400高倍視野。染色強(qiáng)度分級(jí)：無著色為0分，淡黃色著色為1分，棕黃色著色為2分，棕褐色著色為3分。陽性細(xì)胞密度分級(jí)：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分。陽性細(xì)胞密度與染色強(qiáng)度得分相乘即為陽性表達(dá)結(jié)果。腫瘤細(xì)胞、間一項(xiàng)結(jié)果為陽性，則該樣本為陽性表達(dá)。D-1陽性結(jié)果以細(xì)胞計(jì)數(shù)法實(shí)時(shí)評(píng)估。對(duì)切片整個(gè)視野在低倍鏡下觀察，對(duì)淋巴細(xì)胞密度較高位置進(jìn)行查找，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（×400），各計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞中PD-1陽性細(xì)胞數(shù)，PD-1陽性細(xì)胞數(shù)取均值。以閾值為PD-1陽性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞數(shù)高于閾值為陽性表達(dá)，反之，則為陰性表達(dá)。

1.4 觀察指標(biāo)

比較PD-1和PD-L1在胃癌組織與癌旁組織中的表達(dá)情況。分析胃癌組織中PD-1和PD-L1表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，其包括性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度、浸潤層面、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期等。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，以[n（%）]表示計(jì)數(shù)資料，χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1和PD-L1表達(dá)情況

PD-L1蛋白在胃癌組織中陽性表達(dá)率為66.67%（44/66），癌間質(zhì)淋巴細(xì)胞與癌細(xì)胞上表達(dá)陽性率分別為33.33%（22/66）、65.15%（43/66）。 PD-1蛋白表達(dá)陽性腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）數(shù)量為 0～50（14.91±4.51）個(gè)，閾值為14.91，陽性率為 40.91%（27/66）。觀察組中 PD-1和 PD-L1在胃癌組織中陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表 1、圖 1～9。

圖1 胃癌組織中PD-L1陽性

圖4 間質(zhì)中PD-L1陽性

圖5 間質(zhì)中PD-L1陰性

圖6 空白對(duì)照

圖7 胃癌組織中PD-1陽性

圖8 胃癌組織中PD-1陰性

圖9 空白對(duì)照

2.2 PD-1和PD-L1在胃癌組織中表達(dá)與臨床病理因素關(guān)系

PD-L1在胃癌間質(zhì)中表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；PD-L1在胃癌細(xì)胞中表達(dá)與pTNM分期、脈管癌栓、浸潤層面、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）；胃癌組織中PD-1表達(dá)與患者各臨床病理因素?zé)o關(guān)（P＞0.05）。 見表2。

表2 PD-1和PD-L1表達(dá)與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系分析

3 討論

PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)傳遞抑制性信號(hào)，可對(duì)T細(xì)胞的活化起到抑制作用，而造成腫瘤免疫耐受，可誘導(dǎo)T細(xì)胞活化并將腫瘤細(xì)胞殺傷[5-6]。PD-1屬于階段抑制T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)，可經(jīng)多種基因使CD25+調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞產(chǎn)生并維持，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞功能；可有效增強(qiáng)Treg細(xì)胞的活性，促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)展；致使PD-L1、2表達(dá)細(xì)胞的免疫耐受[7-9]。PD-L1屬于Ⅰ型穿膜蛋白，其只有在細(xì)胞膜上表達(dá)才能發(fā)揮生物學(xué)活性，可激活致癌基因和改變IFN-γ表達(dá)以達(dá)到其生物效應(yīng)。PD-L1在癌細(xì)胞中表達(dá)上升可起到促使浸潤、轉(zhuǎn)移的作用，避免CD8+T細(xì)胞攻擊腫瘤細(xì)胞，逃逸機(jī)體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)；可使T細(xì)胞的存活與增殖減少，對(duì)腫瘤惡化與進(jìn)展起到促進(jìn)作用[10-11]。PD-L1可經(jīng)結(jié)合B細(xì)胞上PD-1，使信號(hào)分子Syk、Igα/β發(fā)生去磷酸化，傳遞免疫抑制信號(hào)，避免腫瘤受殺傷系統(tǒng)損害和免疫監(jiān)視。

李毓飛等[12]研究顯示，癌組織中PD-1、PD-L1陽性表達(dá)率分別為 46.67%（35/75）、37.33%（28/75）， 癌旁組織中PD-1、PD-L1 陽性表達(dá)率分別為 25.33%（19/75）、10.67%（8/75）。該研究結(jié)果顯示，觀察組中PD-1和PD-L1陽性表達(dá)率分別為 66.67%（44/66）、40.91%（27/66）， 對(duì)照組中無PD-1和PD-L1蛋白表達(dá)，這與上述研究結(jié)果一致，癌組織中PD-1、PD-L1表達(dá)明顯高于癌旁組織。但兩者陽性率存在明顯差異，這可能與兩者試劑克隆號(hào)不同、檢查方式不同等有關(guān)。癌間質(zhì)淋巴細(xì)胞PD-L1陽性率略高于癌細(xì)胞，可能與癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)誘導(dǎo)周圍淋巴細(xì)胞凋亡或抑制其浸潤所致。癌間質(zhì)中PD-L1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；癌細(xì)胞中PD-L1表達(dá)與浸潤層面、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期有關(guān)。提示PD-L1可經(jīng)影響腫瘤微環(huán)境、調(diào)節(jié)免疫，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移與浸潤；腫瘤切除后PD-1和PD-L1仍有可能在殘余淋巴結(jié)中表達(dá)，容易繼續(xù)影響原發(fā)病灶周圍微環(huán)境的抗腫瘤免疫，導(dǎo)致患者術(shù)后生存期縮短。PD-1與PD-L結(jié)合，經(jīng)引起失活效應(yīng)T細(xì)胞核T細(xì)胞凋亡，對(duì)抗腫瘤免疫起到抑制作用。PD-L1在腫瘤微環(huán)境中負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)與腫瘤細(xì)胞中的上調(diào)，說明阻斷PD-1/PD-L信號(hào)通路，可能成為胃癌免疫治療的新策略。

綜上所述，PD-1和PD-L1蛋白在胃癌組織中表達(dá)顯著升高，而PD-L1與患者臨床病理特征關(guān)系密切，可將其作為胃癌治療的新靶點(diǎn)。