王思偉，王學(xué)清，石少輕，李元迎，王 昆*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北 石家莊 050000；2.河北一獸藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 050000）

奶牛的泌乳行為由神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)分泌的多種激素和乳腺分泌的多種生長因子協(xié)同調(diào)控[1]，其中，以生長激素（growth hormone，GH） 為核心的生長激素軸對奶牛泌乳起重要的調(diào)控作用[2]。但是，GH作為生物大分子，無法直接穿透細胞膜，故需要與位于靶細胞膜上的生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）結(jié)合，經(jīng)由介導(dǎo)體傳遞信息至細胞內(nèi)，才能發(fā)揮其功能。因此，GHR在奶牛機體組織中的含量和功能，以及GHR基因堿基序列的突變都可能影響GH的生理效應(yīng)，從而影響奶牛的產(chǎn)奶性狀[3]。

牛的GHR基因位于第20號染色體[4]，由10個外顯子和9個內(nèi)含子構(gòu)成。Georges等[4]和Arranz等[5]在奶牛第20號染色體上檢測到了影響奶牛泌乳性狀的QTL。Blott等[6]首次發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛GHR基因的cDNA序列第836位存在T→A的單核苷酸突變，導(dǎo)致第279位氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)槔野彼幔‵279Y）。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，該突變位點可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量顯著增加，乳脂率和乳蛋白率顯著下降。這一結(jié)論在芬蘭艾爾奶牛群體中也得到了驗證[7]。因此，奶牛GHR基因的F279Y突變位點被認為是影響奶牛泌乳性狀的重要候選基因之一。

候選基因與數(shù)量性狀的連鎖關(guān)系通常出現(xiàn)在某一群體或特定群體的特定世代中，并與該群體的特定遺傳背景相互作用。因此，為了將候選基因的遺傳效應(yīng)應(yīng)用于畜禽經(jīng)濟性狀的標記輔助選擇中，就需要在不同品種或同一品種的不同群體中不斷進行驗證，甚至在同一群體中也要經(jīng)過多個世代的驗證[8]。河北是我國重要的奶牛養(yǎng)殖區(qū)域，2016年全省奶牛存欄約180.6萬頭，奶類總產(chǎn)量達448.0萬t，居全國第3位。探討河北地區(qū)荷斯坦奶牛GHR基因的遺傳多態(tài)性及其與主要泌乳性狀的遺傳效應(yīng)，以期為奶牛分子標記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為859頭中國荷斯坦奶牛血樣，分別采自河北省石家莊鹿泉、石家莊藁城、石家莊正定、唐山蘆臺和保定的5個牛場，產(chǎn)奶性狀的表型記錄由河北省畜牧良種工作站DHI中心提供。每頭牛采集血液5 mL，即刻放入抗凝離心管中，上下?lián)u動，編號并用冰盒保存，運回實驗室后立即進行奶牛基因組DNA提取，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用血液基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取。

1.2.2 引物合成與PCR擴增 根據(jù)牛GHR基因核酸序列（NM 176608），利用primer premier 6.0引物設(shè)計程序設(shè)計引物，上游引物序列為5’-AATACTTGGGCTAGCAGTGACAATAT-3’，下游引物序列為 5’-ACTGGGTTGATGAAACACTTCACTC-3’。PCR產(chǎn)物的預(yù)期長度為175 bp。

PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL，其中，MasterMix 10.0 μL，上游引物 0.6 μL，下游引物 0.6 μL，基因組DNA模板1.0 μL，超純水7.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；最后，72℃延伸7 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.3 RFLP分析 RFLP反應(yīng)體系為10 μL，其中，PCR產(chǎn)物7.5 μL，限制性核酸內(nèi)切酶SSpⅠ（10 U/μL）0.5 μL，Buffer 2.0 μL。反應(yīng)條件為 37 ℃ 30 min。酶切產(chǎn)物上樣于2.5%瓊脂糖凝膠，恒壓160 V，電泳50～60 min，在紫外燈下觀察拍照，記錄結(jié)果。

1.2.4 測序分析 經(jīng)PCR-RFLP分析后，每個基因型隨機回收純化2個個體的PCR產(chǎn)物，送至北京六合華大基因科技有限公司進行正反方向直接測序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.3.1 基因型頻率和等位基因頻率 根據(jù)公式計算得到。

基因型頻率=基因型個體數(shù)/測定群體總數(shù)

等位基因A的頻率〔p（A）〕：

p（A）=D＋1/2H

等位基因 T的頻率 〔q（T）〕：

q（T） =R＋1/2H

式中，D、H、R分別為AA、TA和TT基因型頻率。

遺傳雜合度（He）：

有效等位基因數(shù)（Ne）：

式中，pi為群體中第i個等位基因的頻率，n為等位基因數(shù)。

多態(tài)信息含量（PIC）：

式中，pi和pj分別為群體中第i和第j個等位基因的頻率，m為等位基因數(shù)。

皮爾遜卡方檢驗：

式中，O代表群體中每個基因型的觀測數(shù)目，E代表假定Hardy-Weinberg平衡定律成立時每個基因型的期望個體數(shù)。

1.3.2 基因型與泌乳性能相關(guān)性分析 采用SAS（8.02）軟件的MIXED過程進行產(chǎn)奶性狀和基因型的關(guān)聯(lián)分析。動物模型為：

式中，y為產(chǎn)奶性狀表型記錄，μ為群體平均值，F(xiàn)為場次效應(yīng)，T為胎次效應(yīng)，G為基因型效應(yīng)，a為加性遺傳效應(yīng)，e為隨機殘差效應(yīng)。

1.3.3 等位基因加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和替代效應(yīng) 根據(jù)公式計算得到。

等位基因加性效應(yīng)：

等位基因顯性效應(yīng)：

等位基因替代效應(yīng)：

式中，p為A等位基因頻率，q為T等位基因頻率，TT、AA和TA分別為各基因型的表型最小二乘均值。

等位基因替代效應(yīng)的顯著性檢驗利用線性回歸模型（SAS），計算泌乳性狀對T等位基因拷貝數(shù)（0、1、2） 的回歸，分別將基因型TT、TA和AA定義為2、1和 0。

2 結(jié)果與分析

2.1 GHR基因F279Y位點的遺傳多態(tài)性分析

以中國荷斯坦?；蚪MDNA為模板，利用設(shè)計的引物擴增GHR基因F279Y位點，獲得了1條長度175bp的片段。采用限制性內(nèi)切酶SSpⅠ消化后，PCRRFLP的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示3種基因型：175 bp，175、151、24 bp，151、24 bp，分別命名為TT、TA和AA。其中，長度24 bp的片段未顯示。

圖1 GHR基因F279Y位點的PCR-RFLP擴增結(jié)果Fig.1 PCR-RFLP amplification results of GHR gene F279Y locus

經(jīng)統(tǒng)計，基因型TT、TA和AA的頻率分別為0.394 6、0.544 8和0.060 5；等位基因T和A的頻率分別為 0.667 1和 0.332 9。PIC為 0.33（0.25＜PIC＜0.50），屬中度多態(tài)。He為0.444 2，Ne為1.799 2，Hardy-Weinberg平衡檢測結(jié)果顯示，該位點在河北荷斯坦奶牛群體中極顯著偏離平衡狀態(tài)。

2.2 GHR基因F279Y位點擴增片段的測序

圖2 GHR基因F279Y位點不同基因型的測序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of different genotypes of F279Y locus of GHR gene

將測序結(jié)果（圖2） 與用GenBank中DGAT1基因的序列（GenBank登錄號：NM 176608） 比對，發(fā)現(xiàn)其與TT基因型的核苷酸序列一致，AA基因型在第4 962 bp位點發(fā)生了T/A單堿基突變。

2.3 GHR基因F279Y位點與泌乳性狀的遺傳效應(yīng)

GHR基因F279Y變異位點對中國荷斯坦奶牛5個泌乳性狀的遺傳分析結(jié)果（表1）顯示，該突變位點對乳脂率的影響達到了顯著水平，而對乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量和305 d產(chǎn)奶量的影響不顯著。多重比較結(jié)果表明，TT基因型的乳脂率顯著高于AA基因型，AA和TA、TT和TA基因型之間的差異不顯著。TA基因型的乳脂量、乳蛋白量和305 d產(chǎn)奶量均高于其他2個純合基因型，但未達到顯著水平。等位基因替代效應(yīng)顯示，每個A等位基因替代T等位基因會導(dǎo)致乳脂率降低0.053%，乳脂量降低0.332 kg，乳蛋白率提高0.003%，乳蛋白量提高1.43 kg，305 d產(chǎn)奶量降低59.481 kg。T等位基因是乳脂率的優(yōu)勢等位基因。

表1 GHR基因F279Y位點基因型與泌乳性狀的遺傳效應(yīng)分析Table 1 The genetic effects of F279Y locus genotypes of GHR gene on the milk production traits

3 結(jié)論與討論

GHR基因是影響奶牛泌乳性狀的重要候選基因之一，明確該基因的遺傳多態(tài)性及其對奶牛泌乳性狀的影響，進行分子標記輔助選擇，對提高奶牛產(chǎn)奶性狀，加快育種進程，實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)品種改良具有深遠意義。Banos等[9]對571頭蘇格蘭荷斯坦奶牛該位點的多態(tài)性進行研究后發(fā)現(xiàn)，等位基因A的頻率為0.20，T的頻率為0.80，TT型為優(yōu)勢基因型，與Sirja等[7]對芬蘭愛爾夏牛的研究結(jié)果一致。王麗娟等[10]對天津和濟南的351頭荷斯坦奶牛進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)等位基因A和T的基因頻率分別為0.633 9和0.366 1，優(yōu)勢等位基因為A，與馬彥男等[1]對甘肅232頭奶牛的檢測結(jié)果一致。而馬妍等[11]對北京地區(qū)1 145頭荷斯坦奶牛進行分析后發(fā)現(xiàn)，等位基因A和T的基因頻率分別為0.361和0.639，優(yōu)勢等位基因為T，與郭曉飛等[12]和楊雪瑤等[13]的研究結(jié)果一致。本研究對河北地區(qū)859頭荷斯坦奶牛的多態(tài)性進行了檢測，結(jié)果表明，等位基因A和T的頻率分別為0.332 9和0.667 1，T為優(yōu)勢等位基因，與馬妍等[11]、郭曉飛等[12]和楊雪瑤等[13]的研究結(jié)果一致。經(jīng)計算，該位點處于中度多態(tài)，遺傳改良潛力較好，等位基因分布較均勻，極度偏離H-W平衡，說明該位點在河北地區(qū)受到了非自然選擇。綜合分析表明，該位點在河北荷斯坦奶牛群體中處于被非自然選擇因素破壞了平衡狀態(tài)，是適合應(yīng)用于遺傳選育的候選位點。

研究證實，GHR基因突變位點F279Y對奶牛的泌乳性狀有顯著影響，但不同研究結(jié)果顯示的影響指標略有不同。Banos等[9]研究表明，等位基因A能提高奶牛的產(chǎn)奶量。Sirja等[7]對芬蘭愛爾夏牛的研究結(jié)果顯示，等位基因A是產(chǎn)奶量的優(yōu)勢等位基因，T是乳脂率和乳蛋白率的優(yōu)勢等位基因。馬彥男等[1]研究表明，AA基因型的305 d產(chǎn)奶量顯著高于AT基因型，AT基因型的乳脂量、乳蛋白量和乳糖量雖然高于AA基因型，但未達到顯著水平；楊雪瑤等[13]則認為，3種基因型之間的305 d產(chǎn)奶量差異不顯著，TT基因型的乳蛋白率和乳脂率極顯著高于其他2個基因型；王麗娟等[10]的研究結(jié)果顯示，TT基因型的乳脂率顯著高于AA型，其他指標未達到顯著水平。本研究發(fā)現(xiàn)，該突變位點對奶牛的乳脂率有顯著影響，等位基因T是乳脂率的優(yōu)勢等位基因，與王麗娟等[10]的研究結(jié)果一致；同時，TA基因型與純合基因型相比具有更高的乳脂量、乳蛋白量和305 d產(chǎn)奶量，但未達到顯著水平，與馬彥男等[1]的研究結(jié)果相似。

綜上所述，GHR基因F279Y突變位點對河北地區(qū)荷斯坦奶牛的乳脂率遺傳效應(yīng)較大，可將其應(yīng)用于分子標記輔助選擇。GHR基因的F279Y位點對奶牛的產(chǎn)奶性能具有重要的調(diào)控作用。但是，由于環(huán)境條件、品種以及選育背景等因素影響，GHR基因的F279Y位點的遺傳多態(tài)性對不同地區(qū)不同群體奶牛泌乳性狀的影響不盡相同。因此，要想將該基因?qū)嶋H應(yīng)用于奶牛品種選育，還需明確該基因?qū)ρ芯咳后w的具體遺傳效應(yīng)，并結(jié)合其他候選基因進行綜合分析。