黃丹娥，李茹月，蔡大可，姚 楠，甘海寧，曾曉會，陳玉興＊＊

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院 廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學廣東省第二中醫(yī)院 廣州 510275）

動脈粥樣硬化是一種脂質(zhì)代謝紊亂和慢性炎癥并存的血管炎性病變疾病，是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的共同病理基礎[1]。巨噬細胞泡沫化是動脈硬化形成的關鍵環(huán)節(jié)，也是動脈粥樣硬化形成的標志[2]。巨噬細胞通過清道夫受體無限制攝取氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）導致巨噬細胞脂質(zhì)過載進而產(chǎn)生泡沫化，隨之分泌大量的炎癥因子。而炎癥因子的產(chǎn)生進一步加劇脂質(zhì)的氧化修飾和局部炎癥反應，加速脂質(zhì)流入巨噬細胞加劇細胞泡沫化過程[3]。巨噬細胞中多余的膽固醇可通過細胞表面的腺苷三磷酸結(jié)合轉(zhuǎn)運體（ABCA1）轉(zhuǎn)運至胞外，然后通過高密度脂蛋白的形式轉(zhuǎn)運至肝臟代謝排出體外，即通過膽固醇逆向轉(zhuǎn)運途徑（RCT）排出體外。大量研究表明配體激活肝X受體α（LXRα）上調(diào)ABCA1表達，促進RCT途徑，同時產(chǎn)生抗炎的藥理作用，是抗動脈粥樣硬化的熱點靶標。因此通過上調(diào)LXRα-ABCA1、抑制ox-LDL刺激巨噬細胞產(chǎn)生的炎癥反應是阻止巨噬細胞泡沫化的有效途徑。

銀藍調(diào)脂膠囊為課題組研發(fā)的調(diào)脂中藥新藥，由絞股藍、銀杏葉、化橘紅、蜂膠組成，前期研究發(fā)現(xiàn)該藥物具有明顯的降脂作用，并已順利獲得由CFDA頒發(fā)的新藥臨床批件（2012L01011)），用于氣滯血瘀型高脂血癥的治療[4]。前期通過計算機輔助藥物設計及ApoE-/-小鼠模型發(fā)現(xiàn)該藥物調(diào)控膽固醇逆向轉(zhuǎn)運關鍵基因和蛋白的表達，提示該藥物對可能對巨噬細胞泡沫化具有抑制作用[5]。因此本研究將基于炎癥及LXRα-ABCA1通路研究銀藍調(diào)脂膠囊對巨噬細胞泡沫化的抑制效果及其作用機制，為該復方臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器

電子分析天平（德國Sartorius公司）；5424型小型高速離心機（德國Eppendorf公司）；-80℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；IQTM5型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；SmartSpec plus核酸蛋白測定儀（美國Bio-Rad公司）；Milli Q Plus超級純水儀（美國Millipore公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；Varioskan Flash型全波長多功能酶標儀（美國Thermo公司）；Class II Type B2型生物安全柜（新加坡Esco公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Cellometer Mini自動細胞計數(shù)儀（美國Nexcelom公司）；DMI8倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.1.2 藥品與試劑

銀藍調(diào)脂膠囊由廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院）制劑研究室提供；ox-LDL購自廣州奕源生物有限公司；油紅O測定試劑盒、總膽固醇含量測試試劑盒，購自南京建成科技有限公司；4%多聚甲醛，購自；LXRα抗體購自美國proteintech公司；ABCA1抗體購自美國Abcam，COX2抗體購自美國proteintech公司；iNOS抗體購自美國Abcam公司，βactin購自美國proteintech公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和DPBS購自美國Gibco公司；總RNA提取試劑Trigol（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo公司）；MaximaTM SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2×）（美國Thermo公司）；特異性引物（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司）；氯仿、異丙醇、無水乙醇均為分析純，購自廣州化學試劑廠，BCA蛋白含量測定試劑盒，購自美國Thermo fisher公司，PBS溶液購自美國Gibco公司。

1.1.3 細胞與動物

RAW264.7細胞系，購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，SPF級SD大鼠20只，體質(zhì)量220-250 g，由廣東省醫(yī)學動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2008-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號No.44007200051918。實驗環(huán)境為廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院SPF級動物實驗室，SYXK（粵）2005-0059。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清制備方法

大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為4組，空白組、銀藍調(diào)脂膠囊高劑量組（5.148 g·kg-1）、中劑量組（2.547 g·kg-1）、低劑量組（1.278 g·kg-1），每組5只，灌胃給藥，每天一次，空白組給予等體積生理鹽水，連續(xù)給藥1周，于第8天給藥2h后腹主動脈采血，3000轉(zhuǎn)/min 4℃離心10 min分離血清，56℃滅活30 min后，于超凈工作臺經(jīng)0.22 μM濾膜過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 含藥血清細胞毒性測試

采用MTT法測定空白血清、銀藍調(diào)脂膠囊高、中、低含藥血清對細胞存活率的影響。取RAW264.7細胞懸液，調(diào)整密度為5×104個/mL，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基的96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基，各組含藥血清按50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%加入細胞中，同時設置不含血清的陰性對照組，每個濃度設置3個復孔，24 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入20 μL MTT（5 mg·mL-1），4 h后，將MTT溶液吸出，加入150 μL DMSO，震搖15 min后，于490 nM處讀取吸光值。以陰性對照組細胞吸光值為參考，各組細胞吸光值所占百分比即為細胞存活率。

1.2.3 泡沫細胞模型構(gòu)建與給藥

參考文獻方法并加以改進[6]，取RAW264.7細胞懸液，調(diào)整密度為5×104個/mL，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基的96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，細胞分為空白組、模型組、銀藍調(diào)脂膠囊含藥血清高、中、低劑量組，除空白組外，其余各組加入ox-LDL 25μg·mL-1誘導泡沫細胞，模型組加入10%空白血清，藥物干預組加入10%高、中、低劑量的含藥血清，24 h后油紅O染色，鏡下觀察。

1.2.4 油紅O染色與脂質(zhì)定量分析

各實驗組干預24 h，PBS清洗細胞2次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，吸棄固定液，PBS清洗3次后根據(jù)油紅O染色試劑盒說明書進行染色操作。染色結(jié)束后吸凈染色液，用PBS洗兩遍，置于光學顯微鏡下觀察細胞泡沫化情況及油脂分布情況。因油紅O染料可在492 nm波長處吸收，且染色后脂質(zhì)極易溶于異丙醇中，故本文脂質(zhì)被油紅O染色后，于96孔板中加入異丙醇（每孔100 μL），至于搖床上萃取5 min，速度為140次/min，萃取完畢后于492 nm處讀取OD值，數(shù)值越大表明脂質(zhì)含量越高。

1.2.5 總膽固醇含量測定

將RAW264.7接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基的6孔板中，接種密度為4×105個/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，按照1.2.3項下加入供試品，干預24 h后，PBS洗細胞2次，棄掉PBS，加入100 μL PBS，用細胞刮刀掛取細胞，收集細胞于1.5 mL EP管中，超聲破碎后，每個樣品各取細胞5 μL按照BCA測試盒說明書操作，測定蛋白含量，其余細胞裂解液加入甲醇：氯仿（1∶3）200μL萃取膽固醇，揮干有機溶劑后，按照總膽固醇含量測試試劑盒的方法測定總膽固醇含量，最終以每g蛋白中膽固醇含量進行定量。

表1 擴增的基因引物信息

1.2.6 RT-qPCR檢測基因表達水平

RAW264.7接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基的6孔板中，接種密度為4×105個/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，加入ox-LDL 25μg·mL-1誘導泡沫細胞，模型組加入10%空白血清、藥物干預組中加入10%含藥血清，24 h后實驗結(jié)束，PBS洗細胞2次，用Trizol法提取總RNA為模板，以OligodT為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物設計利用Primer6.0生物軟件，基因的引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。設計的引物信息如表1所示。引物信息如表1所示。

將cDNA 1μL、dd H2O：0.95 μL、特異性引物F和R各1μL、MaximaTMSYBR Green/Flurescien 12.5 μL混合后，以94℃×5 min；94℃x30 s→5℃×30 s→72℃×50 s（45個循環(huán)）；72℃×7 min進行擴增。運用，2-△△Ct法計算各組基因表達量。各組基因表達量以18S表達量作為內(nèi)參進行比較，計算獲得相對表達量。

1.2.7 Western blot法檢測蛋白表達水平

將RAW264.7接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基的6孔板中，接種密度為4×105個/mL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h后，加入ox-LDL 25μg·mL-1誘導泡沫細胞，模型組加入10%空白血清、藥物干預組中加入10%含藥血清，分別干預12 h、24 h、48 h后收集細胞進行實驗。

收集處理后的細胞，用預冷的PBS洗內(nèi)皮細胞3遍。加預冷的裂解液，4℃裂解30 min并轉(zhuǎn)移至預冷的EP管中。10000 rpm離心10 min后，取上清，收集蛋白，BCA法測定濃度。取蛋白上樣量為45 μg，經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)致PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗4℃孵育過夜，用TBST漂洗3次，加入二抗室溫孵育1.5 h，TBST漂洗3次，用ECL化學發(fā)光法進行檢測。使用ImageJ圖形分析軟件分析條帶的光密度值除以對應的內(nèi)參蛋白條帶β-actin的光密度，再以對照組所得光密度比值為參照（定為1），其他各組的光密度比值除以對照組光密度比值后所得百分數(shù)作為蛋白表達水平。

1.2.8 統(tǒng)計學處理

采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行多組間比較；組間均數(shù)兩兩比較，方差齊時采用SNK法；方差不齊時采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀藍調(diào)脂膠囊對細胞生長的影響

MTT測試結(jié)果如圖1所示，與陰性對照組（不加大鼠血清）比較，50%大鼠血清組顯著性降低細胞存活率（P＜0.02），但在該濃度下銀藍調(diào)脂膠囊高、中、低三個劑量組細胞存活率無顯著差異。與陰性對照組比較銀藍調(diào)脂膠囊高、中、低三個劑量組25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%含藥血清及空白組含藥血清對細胞存活率無顯著性影響，提示在25%及以下血清含量對細胞生長無影響。

2.2 銀藍調(diào)脂膠囊對ox-LDL所致巨噬細胞泡沫化的抑制作用

各實驗組按照油紅O染色法檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積情況。如圖2A所示，與正常對照組比較，模型組巨噬細胞經(jīng)ox-LDL誘導24 h后，細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積明顯增加，被油紅O染成深紫紅色，細胞泡沫化明顯；與模型組比較，銀藍調(diào)脂膠囊高、中、低劑量組均能降低細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，油紅O染色顏色隨著劑量增加逐漸變淺，泡沫化細胞減少。細胞內(nèi)油紅O染色定量分析結(jié)果如圖2B顯示，與正常對照組比較，RAW264.7細胞經(jīng)ox-LDL誘導24 h后，脂質(zhì)堆積明顯升高，OD值由0.09升高到0.86（P＜0.01），而銀藍調(diào)脂膠囊高、中、低劑量含藥血清能顯著降低細胞內(nèi)脂質(zhì)水平，OD值分別為0.21（P＜ 0.01）、0.39（P＜ 0.01）和0.64（P＜ 0.01）。

2.3 銀藍調(diào)脂膠囊對ox-LDL所致泡沫細胞中膽固醇含量的影響

如圖3所示，與正常組相比，ox-LDL誘導后模型組總膽固醇（TC）顯著升高（P＜0.01），由正常組5.97 mmol·g-1升高到13.93 mmol·g-1。經(jīng)銀藍調(diào)脂膠囊含藥血清干預后，與模型組相比，銀藍調(diào)脂含藥血清高、中、低劑量組均顯著降低胞內(nèi)TC水平（P＜0.01），胞內(nèi)TC含量分別為8.99mmol·g-1、10.03mmol·g-1和11.75mmol·g-1。

2.4 銀藍調(diào)脂膠囊對LXRα-ABCA1及炎癥mRNA表達水平的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示（圖4），與空白組比較，經(jīng)ox-LDL誘導后模型組LXRα、ABCA1 mRNA表達顯著降低（P＜0.01），而給予銀藍調(diào)脂膠囊含藥血清組中LXRα、ABCA1 mRNA均有顯著上調(diào)作用（P＜0.01）；與空白組比較，經(jīng)ox-LDL誘導后模型組細胞炎癥因子COX2、iNOS mRNA表達升高（P＜0.01），而銀藍調(diào)脂膠囊含藥血清可顯著性降低炎性因子COX2和iNOS的mRNA表達（P＜0.01）。

圖1 含藥血清對細胞存活率的影響

2.5 銀藍調(diào)脂膠囊對LXRα-ABCA1及炎癥蛋白表達水平的影響

采用不同時間點12 h、24 h及36 h檢測藥物干預LXRα-ABCA1通路和炎癥因子蛋白表達的影響，結(jié)果如圖5所示。如圖5A、C、E所示，與0 h比較，LXRα、ABCA1在給予ox-LDL造模后蛋白水平均顯著降低（P＜0.01），銀藍調(diào)脂膠囊20%含藥血清在給藥12 h、24 h、36 h后，顯著增加LXRα、ABCA1蛋白表達用（P＜ 0.01）；如圖5B、D、F所示，與0 h比較，ox-LDL造模后細胞產(chǎn)生炎癥反應，顯著升高炎癥因子COX2和iNOS蛋白水平，銀藍調(diào)脂膠囊高、中、低三個劑量組10%含藥血清干預后炎癥因子COX2和iNOS蛋白表達水平顯著下降（P＜0.01或P＜0.05）。

圖2 A為不同劑量銀藍調(diào)脂膠囊含藥血清抑制ox-LDL所致巨噬細胞泡沫化脂質(zhì)堆積油紅O染色結(jié)果，隨著藥物劑量增加，染色程度逐漸減輕；B為細胞內(nèi)萃取油紅O定量測定結(jié)果，測定波長為492 nm，與正常組比較：*P ＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P ＜0.01，##P ＜0.01。

圖3 各組樣品ox-LDL誘導泡沫細胞胞內(nèi)膽固醇含量

3 討論

巨噬細胞通過清道夫受體途徑攝取膽固醇，膽固醇堆積引發(fā)巨噬細胞泡沫化，進而在炎癥因子刺激下誘發(fā)動脈粥樣硬化。當前大量研究表明ABC轉(zhuǎn)運體的轉(zhuǎn)運機制是介導膽固醇流出的限速步驟，其中ABC轉(zhuǎn)運體家族中的ABCA1和ABCG1協(xié)同完成單核細胞膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運[7]。LXR是肝臟、腸道以及其他組織中豐富表達的一種核受體，對維持機體膽固醇的相對穩(wěn)定發(fā)揮重要作用，也是調(diào)節(jié)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的重要因素。研究表明，LXR被激活，將上調(diào)其下游基因如ABCAl和ABCG1表達，從而促進巨噬細胞胞內(nèi)膽固醇的流出，加速膽固醇從外周組織流向肝臟，并在肝臟中經(jīng)代謝成膽汁酸排出體外，從而防止泡沫細胞的形成[8,9]。

在動脈粥樣硬化早期階段，除了膽固醇堆積于巨噬細胞導致泡沫細胞產(chǎn)生之外，過多的脂質(zhì)堆積刺激巨噬細胞誘發(fā)炎癥反應，導致動脈壁巨噬細胞粘附，生成脂質(zhì)斑塊，引起平滑肌增殖、遷移，誘發(fā)形成動脈粥樣硬化[10,11]。因此抑制炎癥反應已經(jīng)成為治療動脈粥樣硬化的新策略[12]。

銀藍由銀杏葉、絞股藍等中藥組成，具有益氣健脾、活血化瘀、祛痰利濕等功效，是經(jīng)臨床十余年應用篩選并通過現(xiàn)代藥學制備而成的中藥六類新藥，主要適用于氣虛痰瘀阻痹型高脂血癥的治療。對高脂血癥具有明顯的降低血清中TC、TG的水平，提高LPL、總酯酶活性，降低 LDL-c、ApoA1、ApoB、FFA 的量，提高ApoA1/ApoB比值的作用效果，表現(xiàn)出良好的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用[4]。

本研究結(jié)果提示銀藍調(diào)脂膠囊具有潛在的防治動脈粥樣硬化的藥理作用效果，主要體現(xiàn)在以下3個方面：（1）在泡沫細胞形成抑制方面，銀藍調(diào)脂膠囊能顯著性抑制ox-LDL導致的脂質(zhì)在巨噬細胞中的堆積，并降低細胞中膽固醇的含量；（2）銀藍調(diào)脂膠囊上調(diào)LXRα基因和蛋白的表達，進而激活下游ABCA1基因和蛋白的表達，對膽固醇從巨噬細胞中排除并轉(zhuǎn)運至肝臟排出體外起到了促進的作用；（3）銀藍調(diào)脂膠囊干預后，ox-LDL誘導的細胞內(nèi)炎癥因子COX2和iNOS的mRNA表達水平及蛋白表達水平下降。該研究結(jié)果表明銀藍調(diào)脂膠囊對巨噬細胞泡沫化的抑制作用可能與其激活LXRα上調(diào)ABCA1，降低炎癥因子COX2、iNOS表達水平有關。

圖4 銀藍調(diào)脂膠囊對RCT及炎癥相關基因表達影響結(jié)果

圖5 銀藍調(diào)脂膠囊對LXRα-ABCA1及炎癥相關蛋白表達影響結(jié)果，A、B圖所示為蛋白顯影結(jié)果，C、D、E、F為顯影條帶灰度分析結(jié)果，與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01，##P＜0.01，n=3。

本研究所發(fā)現(xiàn)的銀藍調(diào)脂膠囊在抗動脈粥樣硬化方面的潛力，為深入研究該復方作用機制以及該方進一步深入開發(fā)和臨床應用具有一定的指導意義，同時也為挖掘基于膽固醇外排和抗炎發(fā)現(xiàn)新型抗動脈粥樣硬化中藥提供了借鑒。