劉玥蕓，趙 歆，張 曼，閆秋瑩，姜幼明，岳利峰，陳家旭＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 北京 100700）

慢性應(yīng)激是抑郁、焦慮等情緒障礙的主要致病或誘發(fā)因素，本課題組在既往研究中，成功的運(yùn)用慢性束縛應(yīng)激方式建立了中醫(yī)肝郁脾虛證大鼠模型，并結(jié)合中藥逍遙散對其進(jìn)行了系統(tǒng)的機(jī)制研究[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)抑郁、焦慮等疾病能明顯引起海馬神經(jīng)元再生障礙的發(fā)生，表明慢性應(yīng)激在直接損傷海馬神經(jīng)元的同時還可能引起海馬神經(jīng)元修復(fù)障礙，故神經(jīng)細(xì)胞再生可做為抑郁癥及抗抑郁藥的最終作用靶點(diǎn)[4-8]，但其中涉及的信號傳導(dǎo)通路有哪些，尚不明了。而Notch信號系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)，主要作用是調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的增殖、促神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化和學(xué)習(xí)記憶功能，可以作為一個良好的切入點(diǎn)。

綜上，能導(dǎo)致中醫(yī)肝郁脾虛證的慢性應(yīng)激，通過不同的途徑可以引起海馬神經(jīng)元損傷及再生障礙，而Notch信號通路是其中重要的一種，本實(shí)驗(yàn)選擇Notch信號通路作為切入點(diǎn)，研究其在肝郁脾虛證模型大鼠海馬中的變化，以期找到此通路的調(diào)節(jié)機(jī)制及中藥逍遙散的干預(yù)作用，豐富證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

圖1 大鼠束縛造模

Sprague-Dawley(SD）成年雄性健康大鼠，清潔級，體質(zhì)量180-200 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動物實(shí)驗(yàn)室（SPF級動物實(shí)驗(yàn)室），光照節(jié)律12L：12D（7：00-19：00），室溫22 ± 2℃，相對濕度保持在30%-40%，喂常規(guī)顆粒飼料及飲用水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

1.2.1 中藥

按照《太平惠民和劑局方》原方比例購買柴胡、當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜共4200 g。以上藥材均購于北京同仁堂（毫州）飲片有限責(zé)任公司提供，根據(jù)《北京市中藥炮制規(guī)范》，按原書配伍比例由中日友好醫(yī)院中藥制劑室煎煮、濃縮制成藥粉810 g備用，使用時用去離子水溶解配制成混懸液，按大鼠用藥量進(jìn)行換算使用。

1.2.2 西藥

鹽酸氟西汀膠囊（生產(chǎn)廠：Patheon France；分包裝廠：禮來蘇州制藥有限公司；批號：0955A）作為西藥的陽性對照，規(guī)格20 mg·粒-1（成人用藥量為20 mg·d-1），給藥時按大鼠用藥量進(jìn)行換算。

1.3 主要試劑和儀器

1.3.1 主要試劑

多聚甲醛（北京鼎國昌盛生物有限公司），無水乙醇（分析純）（北京化學(xué)試劑公司），二甲苯（分析純）（北京化學(xué)試劑公司），焦油紫（sigma），苯酚（北京化學(xué)試劑公司），中性樹膠（北京國藥集團(tuán)），Rabbit anti-NICD（abcam），Rabbit anti-Hes5（abcam），Rabbit anti-Hes1（Epitomics），Rabbit anti-Jag1（Epitomics），β-actin（Epitomics），山羊抗兔IgG（HRP）（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司），組織蛋白抽提試劑盒（Pierce），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce），BSA（sigma），蛋白 maker（Fermentas），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce），Tris-Glycine SDS（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司），Tris-Glycine（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司），TBS（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司），SDS-Page凝膠制備試劑盒（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司），SDS-Page Loading Buffer（北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司），總RNA提取試劑盒（Qiagen），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），SYBR Green PCR Master Mix（ABI），瓊脂糖（sigma），GoldStar Taq DNA Polymerase（康為世紀(jì)），100bp-1000bp DNA Ladder（康為世紀(jì)），5×RNA Loading Buffer（康為世紀(jì)）。

1.3.2 主要儀器設(shè)備

全自動組織脫水機(jī)（Leica ASP300S），全自動石蠟包埋機(jī)（Leica EG1150H），輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（Leica RM2245），電熱恒溫干燥箱（Leica），防脫載玻片（世泰），光學(xué)顯微鏡（Nikon E200 Nikon），數(shù)碼相機(jī)（Nikon 4500 Nikon），Imagepro Plus5.0（Media Cybernetics），脫色搖床TS-1型（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司），Western電泳印跡系統(tǒng)（Biometra），微量加樣搶（Eppendorf），凝膠成像系統(tǒng)（KODAK），PVDF膜（MilliPor），普通PCR儀（Eppendorf），DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司），凝膠電泳系統(tǒng)（Biometra），Real-time qPCR 儀（ABI），紫外分光光度儀（UNIC）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組

48只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，根據(jù)體質(zhì)量將大鼠隨機(jī)分為4組，每組12只，即正常組對照（Control Group）、模型組（Model Group）、模型+逍遙散組（Model+XYS Group），模型+氟西汀組（Model+Fluoxetine Group）。群籠飼養(yǎng)，4只·籠-1。

1.4.2 模型制備

除正常組以外的各組大鼠均用束縛架進(jìn)行捆綁束縛造模，3 h·d-1，時間隨機(jī)，連續(xù)21天。正常組不予束縛，但在其他組進(jìn)行束縛的時間內(nèi)禁食水。大鼠束縛架為木質(zhì)結(jié)構(gòu)，底座寬10 cm、長20 cm、厚1 cm。上面束縛臺長22 cm，寬6.6 cm，前端有小架可固定大鼠頭部，束縛臺兩側(cè)分別為兩條可調(diào)節(jié)的粘貼軟帶，用于束縛大鼠的胸部和腹部（圖1）。

1.4.3 給藥

造模開始后同時灌胃給藥（每次束縛前30 min），1次·d-1，給藥體積為1 mL·100g-1體質(zhì)量，人體用藥量換算成大鼠等效劑量，給藥量為逍遙散2.11 g·kg-1體質(zhì)量，氟西汀2 mg·kg-1體質(zhì)量，模型組及正常組給予等體積去離子水。

1.4.4 取材

常規(guī)用10%水合氯醛麻醉大鼠，其中6只給予生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注進(jìn)行前固定后，鍘刀斷頭，冰上取腦，再立即置4℃的4%多聚甲醛，固定72小時后，取材做石蠟包埋；另外6只麻醉后直接冰上取腦，迅速剝離雙側(cè)海馬，分成2份置于凍存管中，投入液氮，后移至-80℃冰箱中保存，分別備用于蛋白質(zhì)的提取和總RNA的提取。

1.4.5 尼氏染色

（1）尼氏染液的配制：

取4 g苯酚加入80 mL純水中配成苯酚水溶液，取焦油紫1 g加入苯酚水溶液中，再加入95%乙醇20 mL，混合配制成100 mL焦油紫原液。用時取適量，再用20%乙醇稀釋20倍，即尼氏染色液。

（2）石蠟切片制備：

①沖洗：從多聚甲醛中取出腦組織，在雙蒸水下沖洗1 min；②脫水與透明：將鼠腦組織沿囟門，切出約4 mm厚的冠狀切片進(jìn)行脫水與透明。脫水順序依次為：70%乙醇20 min，80%乙醇20 min，90%乙醇20 min，95%乙醇20 min，無水乙醇15 min，二甲苯20 min，二甲苯20分鐘；③浸蠟：設(shè)置自動脫水浸蠟機(jī)的溫度為58℃， 浸蠟時間設(shè)置依次為：蠟Ⅰ30 min，蠟Ⅱ30 min，蠟III30 min；④包埋：在全自動石蠟包埋機(jī)中進(jìn)行，將石蠟倒入包埋器中進(jìn)行預(yù)熔，后將組織塊放入完全沒住，將包埋塊放置一旁冷卻；⑤切片：將包埋塊稍作修整，置于輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)上進(jìn)行切片，切片刀角度設(shè)置為7°，切片厚度設(shè)置為7 μm，進(jìn)行切片；⑥展片與貼片：將切好的蠟帶用毛筆挑起，放入溫度為42℃的展片鍋內(nèi)（加入雙蒸水預(yù)熱）展平組織切片。將防脫載玻片以45度角伸入水內(nèi)，輕輕挑起組織切片，使其貼在載玻片外1/3處；⑦烤片：將載玻片置于烘箱中50℃烘干。

（3）尼氏染色

①烤片：烤箱設(shè)置為70℃，載玻片置于內(nèi)烤30 min；②脫蠟：取出載玻片，順序經(jīng)過二甲苯I15 min、二甲苯Ⅱ20 min；③水化：載玻片順序經(jīng)過無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各5 min，再用入雙蒸水中3 min進(jìn)行水化；④染色：將載玻片放入尼氏染色液中，置于37℃溫箱中約8 min。取出，蒸餾水沖洗1 min；⑤分化：將載玻片置于在95%乙醇中，快速分化60 s；⑥脫水透明：常規(guī)脫水透明，載玻片順序經(jīng)過無水乙醇I、無水乙醇Ⅱ各1 min，二甲苯I、二甲苯Ⅱ各 3 min；⑦封片：將中性樹膠一小滴滴于蓋玻片上，45°角緩慢與載玻片粘合，注意不要產(chǎn)生氣泡，封住標(biāo)本，晾干，準(zhǔn)備光鏡下觀察。

1.4.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）

（1）總蛋白的提?。?/p>

將海馬組織取出解凍，加入組織蛋白抽提試劑盒抽提試劑進(jìn)行裂解，手持電動勻漿器勻漿，冰上放置30 min，后4℃、12000 r·min-1離心15 min，所得上清液即為總蛋白。

（2）蛋白定量：

采用BCA法蛋白定量，按照試劑盒說明操作，然后用酶標(biāo)儀進(jìn)行A562測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。

（3）蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠電泳

①首先按照SDS-Page凝膠制備試劑盒說明制備相應(yīng)的蛋白電泳凝膠；②加樣：樣本蛋白與5×樣品緩沖液以4∶l體積混勻，樣本蛋白含量50 μg·孔-1，保證各孔上樣蛋白含量相同;第一孔加入標(biāo)記Marker 5 μl。樣本混勻，95℃水浴5 min，冷卻后依順序到樣品上樣孔中；③電泳：濃縮膠電泳電壓設(shè)置為80 V；觀測到溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，提高電壓到120 V，穩(wěn)定電壓繼續(xù)電泳90 min，直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部；④濕法轉(zhuǎn)膜：結(jié)束電泳后，將膠和PVDF膜夾好放入電轉(zhuǎn)系統(tǒng)中，以120 mA轉(zhuǎn)移90 min；⑤封閉、洗脫：將脫脂奶粉加入TBST溶液中成配置成5%溶液，室溫?fù)u2 h，然后用TBST洗5 min×3次；⑥結(jié)合一抗：將PVDF膜置于雜交袋內(nèi)，以每1 cm PVDF膜加入0.1 mL一抗為量（一抗?jié)舛葹镹ICD：1∶200，Hes1：1∶400，Hes5：1∶400，Jad：1∶1000，β-actin：1∶2000），封閉雜交袋，4℃搖床過夜；⑦孵育二抗：棄去雜交液，TBS洗膜3次，每次10 min。每1 cm PVDF膜加入0.1 ml二抗為量（二抗?jié)舛葹?∶4000），封閉雜交袋，室溫下?lián)u床搖動孵育1小時；⑧顯影：TBST洗膜3次，每次10 min；吸干多余的TBST，用ECL發(fā)光液顯影。

（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像分析

以β-actin作為內(nèi)參照，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用圖像處理軟件分析各蛋白條帶的灰度值，將內(nèi)參灰度值與各組待測蛋白的灰度值作比較，獲得待測蛋白的相對灰度比值。

表1 PCR引物序列表

1.4.7 實(shí)時熒光定量PCR（Real time qPCR）

（1）總RNA的提取

取約100 mg組織置于RNA提取試劑盒所提供的試管中，用手持電動勻漿器進(jìn)行勻漿，按照試劑盒說明添加試劑提取總RNA，將提取出的總RNA儲存于-80℃冰箱中備用。

（2）RNA濃度與純度檢測

吸取1 μL總RNA加無RNA酶水至20 μL，用紫外分光光度計分別測定A260、A280值，以無RNA酶水調(diào)零。A260和A28O的比值能反映RNA中蛋白質(zhì)等有機(jī)物污染程度，當(dāng)A260/A280在1.8-2.0之間表明RNA質(zhì)量較好，無污染或降解，故我們將A260和A28O比值在1.8-2.0之間RNA樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，比值低于1.5或高于2.2者棄去。根據(jù)A260的值計算RNA濃度：A260x稀釋倍數(shù)x40/1000.

（3）實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)

①引物合成，本實(shí)驗(yàn)使用華大基因公司設(shè)計合成的引物，序列如下（表1）；②逆轉(zhuǎn)錄，cDNA第一鏈合成采用Fermentas公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法進(jìn)行，放入普通PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，溫度為42℃60 min，70℃5 min。產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

③ 實(shí)時熒光定量PCR，反應(yīng)體系：5×SYBR Green I PCR buffer 5 μl，上、下游引物（10 pmol·μL-1）各1 μL，dNTP（10 mM）1 μL，Taq 酶（3U·μL-1）1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 10 μL，總體積25 μL。

反應(yīng)條件：

NICD：95℃ 10 min，35個 PCR 循環(huán)（95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

Jag1：95℃ 10 min，35個PCR 循環(huán)（95℃ 30 s、58℃30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

Hes1：95℃ 10 min，35 個 PCR 循環(huán)（95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

Hes5：95℃ 10 min，35 個 PCR 循環(huán)（95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

β-actin：95℃ 10 min，35個PCR 循環(huán)（95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 60 s），72℃ 5 min。

（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過熔解曲線分析定量PCR質(zhì)量。樣品的目的基因和管家基因β-actin分別進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS21.0軟件，對數(shù)據(jù)做正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，兩項(xiàng)均符合，采用單因素方差分析（One-Way，ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計計算。若數(shù)據(jù)不正態(tài)或方差不齊，則采用K個獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)逐項(xiàng)統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 尼氏染色

2.1.1 尼氏染色形態(tài)觀察

尼氏染色顯示正常組大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回區(qū)可見錐體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞，數(shù)量多，排列緊密，神經(jīng)元細(xì)胞核呈橢圓形、圓形，染成淡紫，細(xì)胞核仁能清晰可見，胞漿透明，細(xì)胞形態(tài)正常，尼氏小體染色后呈塊狀（形如虎斑）或顆粒狀，在正常組中尼氏小體豐富、分布正常。模型組大鼠海馬CA1、CA3、齒狀回錐體細(xì)胞、顆粒細(xì)胞排列散亂，形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞核輪廓模糊、界限不清，胞漿中尼氏小體減少；逍遙散和氟西汀組大鼠海馬錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞仍很豐富，神經(jīng)元細(xì)胞核輪廓尚清楚，胞漿尼氏小體有所減少，但神經(jīng)元在形態(tài)改變上較模型組為輕（圖2）。

2.1.2 尼氏小體計數(shù)

與正常組相比，模型組尼氏小體數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與模型組相比，各給藥組的的尼氏體都顯著增多（P＜0.01），提示給藥后能不同程度的減輕尼氏小體在海馬中的丟失情況，改善神經(jīng)元細(xì)胞的狀態(tài)（圖3）。

2.2 蛋白免疫印跡

與正常組相比，模型組Notch信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜ 0.01），給藥組的NICD、Hes1、Hes5蛋白也顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，給藥組的NICD、Hes5、Jag1蛋白表達(dá)均上升（P＜0.05或P＜0.01），Hes1蛋白表達(dá)中，只有氟西汀組與模型組有顯著差異（P＜ 0.05）（圖4（a-d））。

圖2 尼氏染色

2.3 實(shí)時熒光定量PCR

圖3 尼氏小體計數(shù)

與正常組相比，模型組各基因mRNA表達(dá)量均降低（P＜0.01），給藥組只有NICD mRNA表達(dá)量都降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01），Hes1、Hes5無明顯差異，Jad1只有逍遙散組降低明顯（P＜0.05），而氟西汀組已經(jīng)被逆轉(zhuǎn)。與模型組相比，給藥組的NICD、Hes1、Hes5 mRNA表達(dá)均有顯著上升（P＜0.05，P＜0.01），Jag1只有氟西汀組顯著上升（P＜0.01），逍遙散組無顯著差異（圖5（a-d））。

3 討論

圖4 Notch通路各蛋白western bolt結(jié)果

圖5 Notch通路各分子基因表達(dá)情況

尼氏體主要由平行排列的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體組成，主要功能是合成蛋白質(zhì)，作為神經(jīng)活動時所需，如細(xì)胞中的某些成分的更新以及產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)的蛋白質(zhì)和酶類。軸突端的蛋白質(zhì)大都來自胞體的尼氏體。神經(jīng)元在興奮傳導(dǎo)過程中，不斷消耗某些蛋白質(zhì)物質(zhì)，尼氏體可合成新的蛋白質(zhì)以補(bǔ)充這種消耗。一旦尼氏體丟失，就會通過不同途徑引起神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)。以前的大量研究已經(jīng)證明，慢性應(yīng)激會引起腦結(jié)構(gòu)和功能的改變，特別是海馬區(qū)神經(jīng)元丟失，樹突減少，突觸終端結(jié)構(gòu)改變和神經(jīng)元再生抑制等[9]，我們的研究結(jié)果與此一致。海馬神經(jīng)元形態(tài)的改變和尼氏體的丟失說明慢性束縛應(yīng)激所致肝郁脾虛證大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)確實(shí)受到了影響。模型組尼氏小體明顯丟失，顯示了在慢性應(yīng)激過程中海馬神經(jīng)元產(chǎn)生了損傷和凋亡，相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的功能也會受到影響。而經(jīng)過中藥逍遙散和西藥氟西汀干預(yù)過后，尼氏小體丟失的情況得到了明顯改善，提示這幾種藥物能使神經(jīng)元趨向于修復(fù)。

Notch信號系統(tǒng)有很強(qiáng)的分化抑制活性，在成年腦組織主要發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用。本研究結(jié)果顯示，大鼠束縛應(yīng)激造模后，其海馬Notch通路的功能呈下調(diào)趨勢；藥物干預(yù)后，各給藥組大鼠海馬Notch通路各因子（NICD、Hes5、Jag1）蛋白表達(dá)顯著上升。NICD是Notch通路的胞內(nèi)活性片段，代表信號系統(tǒng)的激活，該因子的表達(dá)增加強(qiáng)有力地提示通路功能的上調(diào)。Hesl、Hes5作為Notch信號途徑的靶基因，較之其他因子（如Hes3），與維持神經(jīng)干細(xì)胞在未分化狀態(tài)的聯(lián)系更為緊密。并且發(fā)現(xiàn)在哺乳動物大腦發(fā)育中Hes5可以作為特定標(biāo)記物來區(qū)分神經(jīng)干細(xì)胞與其他祖細(xì)胞[10]。因而，Hesl和Hes5的表達(dá)增加，與促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖有密切關(guān)系。Jagl可通過作用于Notch受體和其下游效應(yīng)器（信號分子Shh等）來促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的生存[11]。Shh是一種分泌蛋白，具有促進(jìn)有絲分裂的功能，Jagl可誘導(dǎo)其的長期表達(dá)。Shh缺失的大鼠，海馬齒狀回的細(xì)胞增殖和神經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重抑制[12]。Jagl的表達(dá)增加，可能通過Shh發(fā)揮其促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用。以上Notch信號通路各因子對神經(jīng)干細(xì)胞的促增殖特性，與本實(shí)驗(yàn)中逍遙散提取物干預(yù)后Notch系統(tǒng)因子表達(dá)的增加，提示該通路可能與逍遙散改善抑郁大鼠海馬的神經(jīng)再生有關(guān)，繼而緩解大鼠肝郁脾虛癥狀。

對照本實(shí)驗(yàn)western blot與RT qPCR的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，XYS干預(yù)下的Jag1基因并未明顯上調(diào)，但其相對應(yīng)的蛋白表達(dá)卻明顯上調(diào)；相反的在XYS干預(yù)下Hes1基因出現(xiàn)了明顯上調(diào)，但其相應(yīng)的蛋白表達(dá)卻沒有上調(diào)。推測可能有以下幾個原因：①基因與蛋白表達(dá)情況相反指出逍遙散在Notch信號通路上的作用靶點(diǎn)可能存在于直接上調(diào)Jag1蛋白中，及阻斷已經(jīng)上調(diào)了的Hes1基因的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中。即基因上調(diào)或下調(diào)的信號在傳遞過程中被干擾，從而直接引起蛋白合成與基因情況不符；②提示逍遙散抗抑郁的機(jī)制與氟西汀不同；③不排除基因表達(dá)不穩(wěn)定以及調(diào)控滯后的可能性。