李曉娟，邱文琪，劉玥蕓，吳佳佳，嚴(yán)志祎，侯雅靜，陳家旭＊＊

（1.暨南大學(xué)中醫(yī)學(xué)院方證研究中心 廣州 510632；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

表觀遺傳學(xué)研究的是在基因的核苷酸序列不變的情況下，基因發(fā)生可遺傳變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科[1]。表觀遺傳學(xué)研究的內(nèi)容包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和非編碼RNA調(diào)控等，其中DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最為深入的[2]。隨著后基因組時(shí)代的到來，新一代先進(jìn)和精尖的高通量測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展，使得DNA甲基化檢測(cè)工具不斷得以拓展和更新，極大地促進(jìn)了DNA甲基化在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的運(yùn)用。特別是研究疾病全基因組DNA甲基化的特點(diǎn)、規(guī)律以及尋找疾病的DNA甲基化生物標(biāo)記物，已經(jīng)成為疾病診斷學(xué)研究的熱點(diǎn)方向。本文綜述了DNA甲基化在中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究中的最新進(jìn)展，文內(nèi)首先介紹了DNA甲基化的基本狀況，然后重點(diǎn)綜述了DNA甲基化研究技術(shù)和DNA甲基化在中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究中的進(jìn)展，最后展望了DNA甲基化研究在中醫(yī)證候研究中的前景。

1 DNA甲基化的基本概況和功能

DNA甲基化是一種DNA的天然修飾。真核生物中，在一組甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases,DNMTs）或甲基化CpG結(jié)合蛋白（Methyl CpG-binding domain，MBD）的作用下，DNA序列中的CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶與甲基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，并轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5-methycytosine,5-mC）的過程[3]。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶（C）-鳥嘌呤（G）二核苷酸（CpG）位點(diǎn)上，約有60-90%[4]。DNA甲基化參與多種生物學(xué)活動(dòng)，包括X染色體滅活、基因轉(zhuǎn)錄、基因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、細(xì)胞分化、外源基因防御、異物代謝等[5]。DNA甲基化修飾在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，體現(xiàn)在其能夠抑制基因轉(zhuǎn)錄，造成基因沉默的作用上。

2 DNA甲基化研究技術(shù)

DNA甲基化檢測(cè)過程主要分為兩大步驟，第一步對(duì)待測(cè)樣品的前期處理；第二步目標(biāo)序列的定位及甲基化狀態(tài)的量化。目前待測(cè)樣品的前期處理方法有亞硫酸氫鈉（sodium bisulfite）處理法和生物素識(shí)別（Biological recognition）處理法。DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)歸納起來主要有三大類，包括基因組整體水平的甲基化檢測(cè)、基因特異位點(diǎn)的甲基化程度檢測(cè)以及尋找新的甲基化位點(diǎn)（表1）。典型全基因組DNA甲基化檢測(cè)的工作流程包括四步（圖1）：第一步全基因組篩選鑒定；第二步數(shù)據(jù)庫分析5′CGIs或CpGs的甲基化或非甲基化DNA狀態(tài)；第三步確立發(fā)生甲基化DNA的分子以及與基因轉(zhuǎn)錄的作用；第四步驗(yàn)證結(jié)果。

表1 DNA甲基化研究技術(shù)

圖1 典型全基因組DNA甲基化檢測(cè)的工作流程[6]

3 中醫(yī)證候的DNA甲基化研究現(xiàn)狀

中醫(yī)“證”是中醫(yī)學(xué)自身認(rèn)識(shí)、診斷、治療以及評(píng)判疾病的核心，也是中醫(yī)區(qū)別于其他任何一門醫(yī)學(xué)科學(xué)的特有物質(zhì)，然而“證”自身復(fù)雜、模糊、多維、動(dòng)態(tài)等特征成為中醫(yī)藥研究的難點(diǎn)之一[7]。然而，“證”作為一種有理存在，其并沒有擺脫“物質(zhì)和功能”這一綜合體，“證”表現(xiàn)在外的證候便是其內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)博弈的產(chǎn)物[8]。因此中醫(yī)“證本質(zhì)”即證的生物學(xué)基礎(chǔ)研究是中醫(yī)藥研究不可回避的重要科學(xué)問題。自上個(gè)世紀(jì)50年代起，中醫(yī)證生物學(xué)基礎(chǔ)研究歸納起來大致經(jīng)歷了4個(gè)大的階段：70年代對(duì)證候動(dòng)物模型的研究、80-90年代對(duì)證候微觀指標(biāo)的研究、90年代至21世紀(jì)初對(duì)病證方物質(zhì)基礎(chǔ)的研究以及目前“組群譜”系統(tǒng)對(duì)證候物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。DNA甲基化是目前研究基因組表觀遺傳修飾最為深入的一類表觀遺傳學(xué)方法。最近幾年間，中醫(yī)藥界的學(xué)者也嘗試從DNA甲基化角度研究證候的生物標(biāo)志物，從而揭示中醫(yī)證候的DNA甲基化生物學(xué)基礎(chǔ)。概括起來，可以分為針對(duì)某個(gè)或某些特定基因甲基化進(jìn)行研究和對(duì)全基因組甲基化進(jìn)行研究?jī)纱箢悺?/p>

3.1 基于特異基因甲基化研究的證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究

基于特異基因甲基化研究的證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究，主要從檢測(cè)感興趣基因的甲基化水平、基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)以及基因位點(diǎn)等方面。唐梅森采用焦硫酸測(cè)序方法研究漢族人群中早發(fā)冠心病血瘀證患者外周血中的ER-α、Gp6、AGTRAP基因甲基化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GP6和AGTRAP基因甲基化水平與早發(fā)冠心病血瘀證發(fā)生相關(guān)，而且ER-α基因啟動(dòng)子位點(diǎn)rs117301可能與早發(fā)冠心病血瘀證的發(fā)展密切相關(guān)[9]。李楠等采用MS-PCR技術(shù)測(cè)定了急性冠脈綜合征痰濁血瘀證患者的雌激素受體（ER）基因和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）基因的甲基化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ER基因的高甲基化狀態(tài)和MMP-9基因的低甲基化狀態(tài)可能與急性冠脈綜合征痰濁血瘀證發(fā)生有關(guān)[10]。陳光等使用亞硫酸測(cè)序研究冠心病不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血細(xì)胞中白細(xì)胞介素-6（IL-6）基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與血瘀證的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前-1118bp至-826bp序列中7個(gè)位點(diǎn)CpG位點(diǎn)的高甲基化與血瘀證有關(guān)[11]。駱杰偉等采用焦磷酸測(cè)序檢測(cè)去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC6A2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與心力衰竭患者氣虛、血瘀證的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心衰患者的氣虛證、血瘀證與SLC6A2基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化升高密切相關(guān)[12]。靖景艷等采用MS-PCR技術(shù)研究不同中醫(yī)證型的急性髓系白血病患者骨髓中RASSF1A基因和ZO-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性髓系白血病虛證和實(shí)證患者的RASSF1A和ZO-1基因甲基化水平存在差異[13]。劉菲等采用MS-PCR技術(shù)研究急性髓系白血病患者骨髓細(xì)胞中ID4基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與中醫(yī)證型的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毒熱熾盛證、瘀血痰結(jié)證患者更易出現(xiàn)ID4基因甲基化[14]。劉慶生等采用焦硫酸測(cè)序法檢測(cè)慢性萎縮性胃炎胃粘膜的c-mycDNA甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在慢性萎縮性胃炎各證型的c-mycDNA甲基化率由高至低依次為：胃熱傷陰證、瘀毒內(nèi)阻證、痰濕凝結(jié)證、脾胃虛寒證、氣血雙虧證和肝胃不和證[15]。江燕等利用焦硫酸測(cè)序方法檢測(cè)AGT甲基化與原發(fā)性高血壓發(fā)生及中醫(yī)各證型的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高血壓患者各中醫(yī)證型的AGT的甲基化狀態(tài)由高至低依次為肝火亢盛證、陰虛陽亢證、痰濕壅盛證和陰陽兩虛證[16]。曾躍琴等采用結(jié)合重亞硫酸鹽測(cè)序方法研究腎陽虛證免疫相關(guān)基因CpG島調(diào)控機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎陽虛患者的血漿中FH1T、MAP2K6、WNT5B、CSNK1D、FRAT2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與腎陽虛證相關(guān)[17]。王萍等采用MSPCR檢測(cè)冠心病血瘀證KLF5和LRP12基因啟動(dòng)子的甲基化率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KLF5和LRP12的啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與冠心病血瘀證關(guān)系不大[18]。黃定鵬等采用MSP法檢測(cè)胃癌的中醫(yī)辨證分型與Runx3基因、Gst-π基因啟動(dòng)子甲基化的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌的各中醫(yī)證型的Runx3基因、Gst-π基因啟動(dòng)子甲基化水平?jīng)]有差異[19]。李雪梅等采用巢式甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)中晚期非小細(xì)胞肺癌患者外周血漿MGMT基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)與中醫(yī)證型的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中晚期非小細(xì)胞肺癌各個(gè)中醫(yī)證型的MGMT基因啟動(dòng)子甲基化水平由高至低依次為脾氣虛證、肺陰虛證、氣滯血瘀證、氣陰兩虛證及痰熱阻肺證[20]。

3.2 基于全基因組甲基化研究的證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究

近年來，零星報(bào)道了證候的全基因組DNA甲基化研究，整體研究存在：技術(shù)選擇相對(duì)單一且滯后、涉及證候范圍比較局限等特點(diǎn)。呼雪慶等采用Human Methylation 450K芯片研究慢性乙型肝炎和慢性乙肝后肝硬化濕熱內(nèi)蘊(yùn)證、肝郁脾虛證和肝腎陰虛證異病同證的外周血DNA甲基化生物學(xué)基礎(chǔ)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KCTD2和NAV1基因的甲基化可能與濕熱內(nèi)蘊(yùn)證相關(guān)LGR6和SH2D4B基因的甲基化可能與肝郁脾虛證相關(guān)CYP2E1、PCSK6、DEXI、HIST1H3B和SULT1C2基因的甲基化可能與肝腎陰虛證相關(guān)[21]。黃海波采用Infinium Human Methylation 450 Bead Array芯片技術(shù)研究早發(fā)冠心病血瘀證家系人群的DNA甲基化標(biāo)記物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外周血的ZEB2基因可能是家系早發(fā)冠心病血瘀證的生物標(biāo)志物[22]。文欽將雙生子選為證候研究的最佳對(duì)象，運(yùn)用DNA甲基化芯片技術(shù)，篩選糖尿病腎虛證的差異表達(dá)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-9、UGDH和GART基因的高甲基化可能與糖尿病腎虛證相關(guān)[23]。

4 結(jié)語和展望

中醫(yī)證候的生物學(xué)基礎(chǔ)研究是中醫(yī)證候現(xiàn)代化研究不可回避的問題，也是中醫(yī)證候需要解決的終極問題。尋找證候生物標(biāo)志物是中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究的核心，生物標(biāo)志物只有具備特異性、靈敏度和穩(wěn)定性高的特點(diǎn)才能為證候診斷和證候用藥提供有價(jià)值的指導(dǎo)意義。DNA甲基化是在保持DNA序列不變情況下，發(fā)生的甲基化修飾能夠?qū)虻霓D(zhuǎn)錄以及功能蛋白的翻譯起著重要的作用。DNA甲基化深受外界環(huán)境和機(jī)體遺傳交互作用的影響，這與中醫(yī)證候形成受先后天影響有異曲同工之妙。然而，縱觀中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)的系統(tǒng)生物學(xué)研究，基因、蛋白和終端代謝物的生物標(biāo)志物研究較多，而從對(duì)基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯起重要影響的DNA甲基化研究卻很少。因此，從全基因組DNA甲基化作為切入點(diǎn)，尋找能夠影響基因轉(zhuǎn)錄的DNA甲基化的中醫(yī)證候標(biāo)志物意義重大，前景樂觀。