孫敏，孫屏，虞蔚，劉建文，王麗佳

(1無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇無錫214000；2無錫市第二人民醫(yī)院；3無錫市婦幼保健院)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌[1]。隨著技術(shù)的進(jìn)展，宮頸癌治療方法從外科手術(shù)為主逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N傳統(tǒng)及新輔助治療相結(jié)合的方法[2]。但宮頸癌復(fù)發(fā)率較高，病死率下降并不明顯[3]。因此，進(jìn)一步了解宮頸癌的發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制有助于改善宮頸癌患者預(yù)后。有研究表明，與表觀遺傳學(xué)表達(dá)相關(guān)的分子可能在宮頸癌的進(jìn)展中具有重要作用[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類重要的表觀遺傳學(xué)表達(dá)相關(guān)分子。lncRNA已被證實能夠通過干擾轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合、干擾沉默基因、干擾臨近基因表達(dá)、參與染色體修飾等作用，廣泛參與細(xì)胞周期調(diào)控、胚胎干細(xì)胞分化、機(jī)體生長發(fā)育等多種生理進(jìn)程[5]。已有多種lncRNA被證實與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6,7]。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)是最早被發(fā)現(xiàn)的lncRNA之一。本研究觀察了宮頸癌組織MALAT1表達(dá)變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取無錫市第三人民醫(yī)院2012年1月～2016年12月收治的宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理科確診為原發(fā)性宮頸癌；②病例資料、組織標(biāo)本保存完整；③患者術(shù)前未經(jīng)放、化療等其他抗腫瘤治療；④患者未合并其他惡性腫瘤；⑤患者未合并其他影響生物指標(biāo)檢測的嚴(yán)重疾病。共納入患者83例，年齡≤55歲46例、>55歲37例；鱗癌71例、腺癌12例；組織分化程度為高分化22例、中分化42例、低分化19例；腫瘤分期為Ⅰ期35例、Ⅱ期39例、Ⅲ期8例、Ⅳ期1例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例。所有患者經(jīng)宮頸細(xì)胞涂片檢查，均為高危型HPV陽性。獲得患者的存檔標(biāo)本83例份。標(biāo)本為于筋膜外全子宮切除術(shù)、次廣泛全子宮切除術(shù)及廣泛性全子宮切除術(shù)中切取的宮頸癌組織及距腫瘤組織邊緣大于5 cm的癌旁正常組織。本研究經(jīng)無錫市第三人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 MALAT1表達(dá)檢測 采用實時熒光定量PCR法。將保存的標(biāo)本取出，PBS沖洗3次，按照RNAisoTMPlus Tatol RNA提取試劑盒(購自日本TaKaRa公司)說明提取總RNA。用紫外分光光度計檢測總RNA純度，取OD260/OD280在1.8～2.0的樣本。按PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自上海名勁生物科技有限公司)使用說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參。MALAT1上游引物序列為5′-GGTAACGATGGTGTCGAGGTC-3′，下游引物序列為5′-CCAGCATTACAGTTCTTGAACATG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下游引物序列為5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，反應(yīng)體系共20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性1 min，再經(jīng)60 ℃退火及延伸45 s，以上循環(huán)40次。以2-ΔΔCt法計算MALAT1相對表達(dá)量。

1.3 預(yù)后觀察 以患者術(shù)后出院為觀察起始，結(jié)合患者復(fù)診病歷，利用電話對患者或其家屬進(jìn)行隨訪。隨訪截至2017年12月。記錄患者生存時間并計算生存率。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織及癌旁正常組織MALAT1表達(dá)比較 宮頸癌組織及癌旁正常組織MALAT1相對表達(dá)量分別為0.413±0.305、0.201±0.192，宮頸癌組織MALAT1相對表達(dá)量高于癌旁正常組織(P<0.05)。

2.2 MALAT1表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ、Ⅳ期宮頸癌患者腫瘤組織MALAT1相對表達(dá)量依次升高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者M(jìn)ALAT1相對表達(dá)量高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P均<0.05)。MALAT1表達(dá)與患者年齡、腫瘤直徑、病理類型、組織分化程度無關(guān)(P均>0.05)。詳見表1。

2.3 宮頸癌組織MALAT1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪時間12～63個月，中位隨訪時間32個月。以宮頸癌組織中MALAT1相對表達(dá)量均數(shù)為界，將宮頸癌患者分為MALAT1低表達(dá)組(50例)與MALAT1高表達(dá)組(33例)。MALAT1低表達(dá)組生存率為88.00%(44/50)、生存時間為(56.9±2.3)個月，MALAT1高表達(dá)組分別為66.67%(22/33)、(46.5±3.8)個月。與MALAT1低表達(dá)組相比，MALAT1高表達(dá)組生存率更低、生存時間更短(P均<0.05)。詳見圖1。

3 討論

全球每年近50萬新發(fā)宮頸癌病例中，超過80%發(fā)生在未普及宮頸癌篩查的發(fā)展中國家。我國

表1 MALAT1表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：與腫瘤分期Ⅰ期者相比，*P<0.05；與腫瘤分期Ⅱ期者相比，#P<0.05；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，△P<0.05。

圖1 MALAT1低表達(dá)組與MALAT1高表達(dá)組Kaplan-Meier生存曲線

每年新發(fā)宮頸癌患者約13萬例，發(fā)病率已高居世界第二位[8]。目前我國宮頸癌防治工作仍以機(jī)會性篩查為主，普通群眾對篩查的參與度仍然不足[9]，且我國公共衛(wèi)生相關(guān)基礎(chǔ)建設(shè)與發(fā)達(dá)國家相比差距明顯，因此衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)相關(guān)的問題日益受到重視[10]。對于接受治療的宮頸癌患者選取合適的預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測，有助于合理分配醫(yī)療資源，最大限度提高患者生存率，延長術(shù)后生存時間。

lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼RNA。不同于傳統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)錄“噪音假說”，lncRNA雖不直接參與編碼蛋白質(zhì)，但在機(jī)體正常生理活動(包括轉(zhuǎn)錄前與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控、表觀遺傳學(xué)修飾及免疫應(yīng)答)中起重要作用[11]，而且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12]。MALAT1定位于染色體11q13.1，全長6.7 kb，由Ji等[13]于觀察非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)并命名。一項研究[14]通過檢測正常組織與惡性腫瘤組織中的多種lncRNA發(fā)現(xiàn)，MALAT1在原發(fā)于食管、膽囊、腦、骨髓、軟骨、卵巢等17種不同部位的惡性腫瘤組織中高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織MALAT1表達(dá)增高，與MALAT1在其他惡性腫瘤組織中的表達(dá)趨勢一致，提示MALAT1的異常表達(dá)可能與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)。

Guo等[15]于體外實驗中利用短發(fā)夾RNA抑制人宮頸癌CaSki細(xì)胞中MALAT1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MALAT1可通過調(diào)控Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2、Bcl-xL等基因相關(guān)信號通路，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、加速細(xì)胞周期進(jìn)程，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲力。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)，敲除MALAT1基因的宮頸癌HeLa與SiHa細(xì)胞出現(xiàn)增殖減慢、侵襲抑制、凋亡增加等效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1表達(dá)與宮頸癌腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MALAT1能夠促進(jìn)宮頸癌的增殖與侵襲等惡性進(jìn)展。

研究顯示，臨床分期、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、治療方式等為宮頸癌患者的重要預(yù)后因素[17,18]。本研究隨訪結(jié)果顯示，與MALAT1低表達(dá)組相比，MALAT1高表達(dá)組生存率更低、生存時間更短，這從臨床結(jié)局方面印證了MALAT1可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖與侵襲。已有研究表明，MALAT1表達(dá)較高的多發(fā)性骨髓瘤[19]、膀胱癌[20]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[21]等惡性腫瘤患者預(yù)后均較差。本研究結(jié)果與上述報道基本一致。因此，對于MALAT1表達(dá)較高的患者，需要加強(qiáng)術(shù)后監(jiān)護(hù)，合理應(yīng)用輔助抗腫瘤技術(shù)，以提高患者術(shù)后生存率，延長術(shù)后生存時間。

綜上所述，MALAT1在宮頸癌組織中異常高表達(dá)，且與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。MALAT1低表達(dá)患者預(yù)后優(yōu)于MALAT1高表達(dá)患者，因此MALAT1有望成為評估宮頸癌患者預(yù)后的新指標(biāo)。