張秀義，許浩然，孫亞東

(承德市中心醫(yī)院，河北承德067000)

肺癌的發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤前三位，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題之一。絕大多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已屬晚期，預(yù)后極差。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期控制基因突變導(dǎo)致正常細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)失控及機(jī)體抗凋亡功能異?？哼M(jìn)是腫瘤形成的重要原因。細(xì)胞自噬是將細(xì)胞內(nèi)折疊錯(cuò)誤、老化的蛋白質(zhì)及受損后失去作用的細(xì)胞器在溶酶體內(nèi)降解的過程[1]。自噬作為一種細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的降解通路，是真核細(xì)胞所特有的代謝途徑。當(dāng)腫瘤細(xì)胞增殖過度活躍時(shí)，會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬性凋亡，抑制腫瘤生長。機(jī)體內(nèi)存在多種自噬調(diào)控基因，其功能異常引起的細(xì)胞自噬活性改變與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。自噬相關(guān)蛋白Beclin1主要誘導(dǎo)自噬的啟動(dòng)，是自噬中最重要的正向調(diào)節(jié)因子。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)是惟一定位于自噬泡內(nèi)膜的自噬相關(guān)蛋白，主要作用是促進(jìn)自噬小體的成熟，其表達(dá)變化可反映細(xì)胞自噬活性。本研究觀察了非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織Beclin1、LC3表達(dá)變化，并分析二者表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討細(xì)胞自噬在NSCLC發(fā)生、發(fā)展病中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月～2018年3月在承德市中心醫(yī)院行外科手術(shù)治療的NSCLC患者96例，術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療。其中，男62例、女34例，年齡48～75(61.4±8.34)歲；組織學(xué)類型：腺癌46例，鱗癌50例；組織分化程度：高分化38例，低中分化58例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例。對照標(biāo)本取自NSCLC組織遠(yuǎn)端正常支氣管及肺泡組織(距腫瘤邊緣3～5 cm)，其中支氣管組織60例份、肺泡組織64例份。本研究經(jīng)承德市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 Beclin1、LC3表達(dá)檢測 采用免疫組化SP法。將組織標(biāo)本用4%甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，4 μm厚切片，烤干后保存。經(jīng)環(huán)保透明劑脫蠟、梯度乙醇脫水后，加入檸檬酸緩沖液修復(fù)。正常山羊血清工作液封閉，然后加入一抗(Beclin1、LC3)，4 ℃孵育過夜。次日加入生物素化二抗工作液及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用已知Beclin1、LC3陽性的組織切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。采用雙盲法由兩名資深病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片，結(jié)果不一致時(shí)，由第三名病理科醫(yī)師最終判定。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每視野觀察100個(gè)細(xì)胞，Beclin1、LC3陽性染色均定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或褐色細(xì)顆粒狀。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度綜合判定陽性表達(dá)。陽性細(xì)胞所占比例評分：≤5%為0分，﹥5%～25%為1分，﹥25%～50%為2分，>50%為3分；染色強(qiáng)度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)得分相加≤3分為陰性表達(dá)，>3分為陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織Beclin1、LC3表達(dá)比較 Beclin1在NSCLC及正常肺泡、支氣管組織中的陽性表達(dá)率分別為31.25%(30/96)、75.0%(48/64)、66.67%(40/60)。NSCLC組織Beclin1陽性表達(dá)率明顯低于正常肺泡、支氣管組織(χ2分別為29.418、18.723，P均<0.01)，而正常肺泡與支氣管組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.044，P﹥0.05)。LC3在NSCLC及正常肺泡、支氣管組織中的陽性表達(dá)率分別為26.04%(25/96)、81.25%(52/64)、80.0%(48/60)。NSCLC組織LC3陽性表達(dá)率明顯低于正常肺泡、支氣管組織(χ2分別為46.883、43.178，P均<0.01)，而正常肺泡與支氣管組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.031，P﹥0.05)。

2.2 不同臨床病理特征NSCLC患者腫瘤組織Beclin1、LC3陽性表達(dá)比較 腫瘤直徑>3 cm、組織分化程度低中分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者NSCLC組織Beclin1陽性表達(dá)率較腫瘤直徑≤3 cm、組織分化程度高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯降低(P<0.05或<0.01)；組織分化程度低中分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者NSCLC組織LC3陽性表達(dá)率較組織分化程度高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯降低(P均<0.01)。見表1。

表1 不同臨床病理特征NSCLC患者癌組織Beclin1、LC3陽性表達(dá)比較

2.3 NSCLC組織Beclin1陽性表達(dá)與LC3陽性表達(dá)的關(guān)系 NSCLC組織Beclin1陽性表達(dá)與LC3陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.419，P<0.05)。

3 討論

細(xì)胞自噬是細(xì)胞器和大分子物質(zhì)在自噬體中降解的過程，通過降解細(xì)胞內(nèi)衰老或因外界環(huán)境壓力導(dǎo)致破損的細(xì)胞器、老化的蛋白質(zhì)以及合成或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的自我修復(fù)和蛋白質(zhì)的循環(huán)利用，加強(qiáng)細(xì)胞檢查糾錯(cuò)作用，穩(wěn)定細(xì)胞基因組，保持細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài)。自噬活性長期受到抑制，有害因素在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)積累，可導(dǎo)致腫瘤形成。人類絕大多數(shù)腫瘤中存在細(xì)胞自噬功能異常。惡性腫瘤組織營養(yǎng)需求旺盛，自噬可為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)，此時(shí)提高自噬活性有助于度過營養(yǎng)危機(jī)。放化療后大量異常蛋白質(zhì)及破損細(xì)胞器生成，自噬及時(shí)清除這些物質(zhì)，可減輕有害物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞的損傷。研究顯示，在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等細(xì)胞中存在自噬正向調(diào)節(jié)因子缺失[2～4]；細(xì)胞自噬被抑制后，在乳腺癌、結(jié)腸癌及睪丸癌等均觀察到由環(huán)境壓力導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡增多。因此，細(xì)胞自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有雙重作用，一方面細(xì)胞自噬能穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境使腫瘤細(xì)胞耐受缺氧環(huán)境，維持細(xì)胞存活；另一方面，當(dāng)細(xì)胞自噬過度亢進(jìn)，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

Beclin1基因是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中惟一特異性自噬基因，其編碼蛋白與磷酯酰肌醇3激酶家族Ⅲ形成自噬體，介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于吞噬泡，在自噬體的形成及成熟過程中發(fā)揮重要作用，是重要的抑癌基因。研究證實(shí)，Beclin1基因缺失及蛋白表達(dá)降低與腫瘤發(fā)生顯著相關(guān)。小鼠細(xì)胞Beclin1的等位基因被敲除后，肺癌、肝癌、淋巴癌的發(fā)生率明顯升高[5]，Beclin1+/-突變小鼠較野生型小鼠更易于誘發(fā)腫瘤。在人類腫瘤細(xì)胞中，Beclin1蛋白與PI3K形成復(fù)合體，可調(diào)節(jié)Atg蛋白在吞噬泡結(jié)構(gòu)中的定位；其過表達(dá)能促進(jìn)自噬小體成熟，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬活性增加[6]。有研究顯示，卵巢癌、乳腺癌、乳腺導(dǎo)管癌及宮頸癌組織中Beclin1蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低[7～9]，原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織Beclin1蛋白表達(dá)明顯高于正常肝組織[10，11]，結(jié)直腸癌和胃癌組織中Beclin1過表達(dá)。目前認(rèn)為，不同類型腫瘤組織中的表達(dá)差異可能與Beclin1對細(xì)胞自噬調(diào)控的雙重性有關(guān)。消化系統(tǒng)腫瘤Beclin1高表達(dá)通過加強(qiáng)自噬活性，減輕腫瘤增殖過程中缺血、缺氧及有害物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而發(fā)揮腫瘤保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，Beclin1在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率明顯低于正常肺組織，提示在肺癌組織中Beclin1基因轉(zhuǎn)錄減少及其蛋白表達(dá)缺失，自噬活性明顯降低，自噬體形成減少，腫瘤細(xì)胞自噬功能下降、凋亡不足，導(dǎo)致異常細(xì)胞持續(xù)增加，最終形成腫瘤。進(jìn)一步分析顯示，腫瘤直徑>3 cm、組織分化程度低中分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者NSCLC組織Beclin1陽性表達(dá)度較腫瘤直徑≤3 cm、組織分化程度高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯降低，提示Beclin1在NSCLC早期表達(dá)活躍。其表達(dá)隨腫瘤組織分化程度降低而逐漸下降，考慮為Beclin1基因低表達(dá)及蛋白缺失可使有缺陷的細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞生長呈現(xiàn)無節(jié)制、不受控狀態(tài)。Beclin1表達(dá)越少，組織分化程度越低，腫瘤惡性傾向越明顯。腫瘤晚期Beclin1完全失活，逐漸喪失其抑癌功能，更具侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，故患者預(yù)后較差。

LC3是惟一定位于自噬泡內(nèi)膜的自噬調(diào)節(jié)蛋白。當(dāng)細(xì)胞自噬啟動(dòng)后，LC3前體首先加工成LC3-Ⅰ并溶于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合生成LC3-Ⅱ。只有與PE結(jié)合狀態(tài)的的LC3-Ⅱ定位于自噬泡膜上，才能發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，故LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)與自噬泡數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系，可直接反映細(xì)胞自噬活性[12]。胃癌、結(jié)直腸癌及宮頸癌等組織中LC3異常表達(dá)[13]。Wu等[14]報(bào)道，LC3在中低分化結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯低于高分化結(jié)直腸癌組織，在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織LC3陽性表達(dá)率明顯低于正常組織，組織分化程度低中分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者NSCLC組織LC3陽性表達(dá)率較組織分化程度高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯降低。提示在NSCLC中細(xì)胞自噬活性下調(diào)，隨著組織分化程度下降及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其表達(dá)逐漸降低，推測LC3低表達(dá)可能與NSCLC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中，LC3表達(dá)下調(diào)使自噬體生成減少，自噬活性降低，增加了腫瘤易感性，促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織Beclin1陽性表達(dá)與LC3陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。推測兩者作為細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)通路的上下游靶點(diǎn)，具有協(xié)同促癌作用；其同步低表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞自噬能力降低、內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)能力障礙，可導(dǎo)致NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。NSCLC形成以后，Beclin1作為抑癌基因激活細(xì)胞自噬，LC3加快自噬小體成熟速度，二者共同促進(jìn)細(xì)胞自噬活性增加，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞程序性死亡，從而產(chǎn)生抑癌作用；腫瘤細(xì)胞增殖失控導(dǎo)致其長期處于缺血、缺氧狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)有毒有害物質(zhì)大量堆積，刺激腫瘤細(xì)胞的自噬活性持續(xù)升高，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。

綜上所述，NSCLC組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3表達(dá)降低，細(xì)胞自噬對NSCLC的發(fā)生、發(fā)展可能具有抑制作用。