黃雷，殷濤，崔殿生

(湖北省腫瘤醫(yī)院，武漢430079)

胃癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，在全世界的惡性腫瘤病死率中高居第2位[1]。目前，胃癌的發(fā)病機(jī)制仍未研究清楚。信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)蛋白家族是一組可被不同細(xì)胞因子受體激活的蛋白，能特異性地在細(xì)胞內(nèi)傳遞信號。STAT3是STAT蛋白家族成員之一，可在多種信號傳遞過程中被激活，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用；STAT3也被認(rèn)為是一種癌基因，廣泛表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織中，其激活狀態(tài)即磷酸化STAT3(p-STAT3)，可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。生存素(survivin)是一種凋亡抑制因子，廣泛表達(dá)于各種腫瘤細(xì)胞或組織中，是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員之一，可參與抑制細(xì)胞凋亡。髓樣細(xì)胞白血病1(Mcl-1)是一種特殊的蛋白質(zhì)，屬于抗凋亡蛋白,最初在人髓樣白血病細(xì)胞系的分化中發(fā)現(xiàn)[2]，在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究觀察了胃腺癌組織p-STAT3、survivin和Mcl-1蛋白表達(dá)變化，并分析其與胃腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，旨在探討p-STAT3、survivin和Mcl-1在胃腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014～2016年湖北省腫瘤醫(yī)院診斷明確的胃腺癌患者，術(shù)中收集胃腺癌組織57例份(觀察組)及相應(yīng)癌旁正常胃黏膜組織53例份(對照組)。其中，男35例，女22例；年齡41～81歲，<60歲25例、≥60歲32例；腫瘤直徑：<5 cm 39例，≥5 cm 18例；浸潤深度：未侵及漿膜12例，侵及漿膜45例；組織分化程度：高中分化12例，低未分化45例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期18例，Ⅲ、Ⅳ期39例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例?；颊咝g(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。本研究經(jīng)湖北省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 p-STAT3、survivin和Mcl-1蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化SP法。兔抗人p-STAT3、兔抗人survivin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，Mcl-1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；山羊抗鼠IgG二抗、免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒及其他試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有標(biāo)本常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，微波加熱抗原修復(fù)，室溫自然冷卻。按照試劑盒說明常規(guī)行免疫組化SP染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性組織切片作為陽性對照。陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例及染色程度綜合判定陽性表達(dá)。陽性細(xì)胞所占比例評分：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分；染色程度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項(xiàng)評分乘積≤3為陰性表達(dá)、>3為陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組p-STAT3、survivin、Mcl-1蛋白表達(dá)比較 觀察組p-STAT3、survivin、Mcl-1蛋白陽性表達(dá)率分別為78.95%(45/57)、70.18%(40/57)、75.44%(43/57),對照組分別為18.87%(10/53)、22.64%(12/53)、30.19%(16/53)。兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。

2.2 胃腺癌組織p-STAT3、survivin、Mcl-1蛋白陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 p-STAT3、survivin、Mcl-1蛋白陽性表達(dá)在腫瘤侵及漿膜者高于未侵及漿膜者，組織分化程度低未分化者高于中高分化者，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期者高于Ⅰ、Ⅱ期者，腫瘤直徑≥5 cm者高于<5 cm,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P均<0.05)，三者陽性表達(dá)在不同性別、年齡腫瘤組織間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 胃腺癌組織p-STAT3、survivin、Mcl-1蛋白陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃腺癌組織p-STAT3、survivin、Mcl-1蛋白陽性表達(dá)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，胃腺癌組織p-STAT3蛋白陽性表達(dá)與survivin、Mcl-1蛋白陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.334、0.417，P均<0.05)，survivin蛋白陽性表達(dá)與Mcl-1蛋白陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.342，P<0.05)。

3 討論

隨著細(xì)胞分子生物學(xué)研究的進(jìn)步，對胃癌的研究已經(jīng)進(jìn)入分子水平，并取得了較大研究成果。近年越來越多研究顯示，STAT3在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵性作用，尤其是p-STAT3，能明顯促進(jìn)胃癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。STAT3是細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的關(guān)鍵因子，在受到外界信號刺激后，以活化的p-STAT3進(jìn)入細(xì)胞核中，啟動(dòng)并調(diào)控其下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤無限生長。Yu等[3]研究顯示，STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)在胃癌早期即可明顯升高，可作為胃癌早期診斷的指標(biāo)之一。但更多的研究顯示，STAT3信號通路相關(guān)蛋白不僅僅在胃癌早期表達(dá)升高，在進(jìn)展期和晚期亦可過表達(dá)。Chen等[4]研究提示，過表達(dá)STAT3信號通路相關(guān)蛋白能顯著增加胃癌細(xì)胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移，抑制其表達(dá)則能明顯降低胃癌細(xì)胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移。Ollila等[5]研究發(fā)現(xiàn)，STAT3與胃腸道腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，Tao等[6]也得出相同的研究結(jié)論。說明STAT3信號通路在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

胃癌是以高病死率為特征的惡性腫瘤，主要是因?yàn)槲赴┚哂懈咿D(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，患者預(yù)后非常差。有研究顯示，激活STAT3信號通路，能明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，而抑制STAT3信號通路則能明顯抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲[7]。但STAT3信號通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲機(jī)制尚不清楚。Luo等[8]研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有關(guān)鍵性作用；STAT3還能促進(jìn)G1期細(xì)胞向S期細(xì)胞轉(zhuǎn)變，特別是在胃癌細(xì)胞中表現(xiàn)尤為突出。但STAT3信號通路影響細(xì)胞周期的機(jī)制尚不清楚。Ma等[9]研究顯示，與癌旁正常組織相比，胃癌組織STAT3高表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，激活STAT3信號通路能明顯增加腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，而且在腫瘤轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)更明顯，說明STAT3在胃癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，p-STAT3蛋白陽性表達(dá)在腫瘤浸潤侵及漿膜者高于未侵及漿膜者，組織分化程度低未分化者高于中高分化者，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期者高于Ⅰ、Ⅱ期者，腫瘤直徑≥5 cm者高于<5 cm者,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。說明p-STAT3蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，與上述研究結(jié)論一致。

研究發(fā)現(xiàn)，STAT3可通過調(diào)節(jié)其下游靶基因表達(dá)，如Mcl-1、survivin、Bcl-2及VEGF等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[10]。survivin基因于1997年被耶魯大學(xué)Ambro-sini教授首先發(fā)現(xiàn)[11]，是IAP家族中相對分子質(zhì)量最小的蛋白。survivin的主要作用是抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)還能影響化療藥物敏感性。survivin在分化良好的組織中幾乎不表達(dá)[12]，但可高表達(dá)于胃癌、結(jié)直腸癌及胰腺癌組織。研究發(fā)現(xiàn)，survivin蛋白產(chǎn)物可高選擇性地結(jié)合并降解活化的Caspase-3、Caspase-7,直接抑制Caspase-3、Caspase-7活性及其與周期蛋白激酶相互作用，阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[13]。survivin基因還參與細(xì)胞的有絲分裂，在G1期轉(zhuǎn)錄明顯增加,導(dǎo)致細(xì)胞分裂缺陷，易形成多倍體細(xì)胞；而且，過表達(dá)的survivin基因能夠逃避有絲分裂的檢查，破壞宿主細(xì)胞的吞噬功能，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[13]。Kamran等[14]研究認(rèn)為，survivin基因在胃癌細(xì)胞的有絲分裂期間發(fā)揮重要作用。本研究顯示，survivin蛋白在胃腺癌組織中的陽性表達(dá)率高于正常胃黏膜組織，提示survivin蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用；同時(shí)，survivin蛋白陽性表達(dá)在胃癌組織分化程度、浸潤深度、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面均有差異，說明survivin蛋白可參與胃癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移。Dizdar等[15]指出，survivin基因在胃癌的早期階段發(fā)揮重要作用，且與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明確相關(guān)。Guo等[16]同樣指出，survivin基因在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，可作為胃癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。本研究顯示，胃腺癌組織p-STAT3蛋白陽性表達(dá)與survivin蛋白陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。提示p-STAT3可能調(diào)控其下游基因survivin的表達(dá)，共同作用導(dǎo)致胃癌的發(fā)生、發(fā)展。但survivin基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

Mcl-1的結(jié)構(gòu)與Bcl-2具有高度同源性，是Bcl-2家族抗凋亡分子成員之一。Mcl-1的半衰期非常短，主要是通過穩(wěn)定線粒體膜，阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)，延緩細(xì)胞凋亡進(jìn)程。Mcl-1在多種腫瘤組織中高表達(dá)[17，18]，尤其在胃癌及結(jié)直腸癌組織。Mcl-1主要通過影響細(xì)胞分裂周期及降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的抗凋亡途徑。Akagi等[19]研究顯示，Mcl-1可能降低胃癌細(xì)胞對5-FU及鉑類化合物的敏感性，其作用機(jī)制與阻斷細(xì)胞內(nèi)線粒體自身凋亡途徑，抑制胃癌細(xì)胞凋亡過程有關(guān)。Shuang等[20]指出，上調(diào)Mcl-1表達(dá)可降低紫杉醇對胃癌細(xì)胞的化療敏感性，其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)；上調(diào)Mcl-1表達(dá)可抑制細(xì)胞外線粒體酶的通透性，阻礙紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。近年來，抗凋亡蛋白抑制劑不斷被發(fā)現(xiàn)，很多小分子蛋白質(zhì)通過結(jié)合到Bcl-2家族抗凋亡蛋白上發(fā)揮抑制凋亡的作用。這些小分子抑制劑對細(xì)胞膜有高度通透性，更易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，有利于細(xì)胞毒性藥物的吸收，在抑制細(xì)胞凋亡的同時(shí)發(fā)揮抗腫瘤作用。最近研究顯示，抑制FoxM1/Mcl-1信號通路能明顯破壞細(xì)胞活性，增加鉑類化合物對胃癌細(xì)胞的化療敏感性[21]。Yu等[22]研究顯示，過表達(dá)Mcl-1能明顯抑制JAK/STAT信號通路激活，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞無限增殖和凋亡受阻。本研究結(jié)果顯示，Mcl-1蛋白表達(dá)在腫瘤浸潤侵及漿膜者高于未侵及漿膜者，組織分化程度低未分化者高于中高分化者，臨床分期Ⅲ、Ⅳ期者高于Ⅰ、Ⅱ期者，腫瘤直徑≥5 cm者高于<5 cm者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。結(jié)果充分說明，Mcl-1蛋白與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Likui等[23]研究結(jié)果顯示，Mcl-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)高于正常胃黏膜組織,且與胃癌的T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管和脈管浸潤以及5年生存率密切相關(guān)。本研究結(jié)果與該研究結(jié)論高度一致，提示Mcl-1高表達(dá)在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

本研究還顯示，胃腺癌組織p-STAT3蛋白陽性表達(dá)與survivin、Mcl-1蛋白陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示p-STAT3可上調(diào)survivin、Mcl-1蛋白表達(dá)，而過表達(dá)survivin和Mcl-1蛋白可促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，并可導(dǎo)致患者不良預(yù)后。

綜上所述，STAT3信號通路可參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，其活化狀態(tài)能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并調(diào)節(jié)其下游基因survivin、Mcl-1蛋白轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。檢測胃腺癌組織STAT3及其下游基因survivin和Mcl-1蛋白表達(dá)可能有助于判斷胃癌的進(jìn)展及患者預(yù)后。