張泉，周奕奕，樊星，韓鴻玲

(1 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院,天津300052；2 天津市第四中心醫(yī)院)

中國高尿酸血癥相關(guān)疾病診療多學(xué)科專家共識將血尿酸水平>7 mg/dL定義為高尿酸血癥，并指出其與心血管疾病、高血壓、代謝綜合征等密切相關(guān)[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸水平不僅能導(dǎo)致動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能受損[2]，還可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)、激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，引起動脈粥樣硬化。但目前高尿酸血癥對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞影響的報道較少，其作用機制尚不完全清楚。2016年5月～2017年2月，我們觀察了體外高濃度尿酸對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的影響，并探討其可能的作用機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(HRGEC)，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。尿酸(U2625-25G，≥99%)，美國Sigma公司；實驗前用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配制成4、8、16 mg/dL的尿酸溶液。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。倒置熒光顯微鏡，美國BD公司；多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo Scientific公司；實時熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)移裝置，美國Bio-Rad公司。TRIzol，美國Invitrogen公司；CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒，上海BestBio貝博生物公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司；核因子-κB(NF-κB) p65、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)一抗，英國Abcam公司；內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)一抗，美國CST公司；單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)一抗，美國BD公司；β-actin二抗，美國Absci公司。

1.2 實驗分組處理 HRGEC常規(guī)傳代培養(yǎng)，取傳5～15代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好細(xì)胞，接種于含10% FBS RPMI 1640培養(yǎng)基的6孔板，每孔4×105個，隨機分為陰性對照組、生理濃度尿酸組、中濃度尿酸組、高濃度尿酸組，每組設(shè)3個復(fù)孔。然后將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中至少培養(yǎng)24 h。當(dāng)孔內(nèi)細(xì)胞呈均勻單層生長時，更換新的培養(yǎng)基，各組分別加入0、4、8、16 mg/dL的尿酸溶液，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞活性檢測 采用CCK-8法。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值。以O(shè)D450值代表細(xì)胞活性。

1.4 eNOS、ICAM-1、MCP-1、NF-κB p56表達檢測 ①eNOS、ICAM-1、MCP-1、NF-κB p56 mRNA表達：采用RT-PCR法。收集各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外-可見光分光光度計鑒定，提取的總RNA純度和濃度合格，符合后續(xù)實驗要求。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：eNOS上游引物5′-GGAGAAGATGCCAAGGCTGCT-3′，下游引物5′-CTTCCAGTGTCCAGACGCACC-3′；ICAM-1上游引物5′-TCTTCCTCGGCCTTCCCATA-3′，下游引物5′-AGGTACCATGGCCCCAAATG-3′；MCP-1上游引物5′-ACCTGGACAAGCAAACCCAA-3′，下游引物5′-AGGGTGTCTGGGGAAAGCTA-3′；NF-κB p65上游引物5′-AAAAACGCATCCCAAGGTGC-3′，下游引物5′-AAGCTCAAGCCACCATACCC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GCTCGTTCTACGGCACAGG-3′，下游引物5′-GCACGTAGTCTCCACGACAT-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2×SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，RNase-free ddH2O 8 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性10 s、62 ℃退火30 s共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。②eNOS、ICAM-1、MCP-1、NF-κB p56蛋白表達：采用Western blotting法。收集各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h細(xì)胞，采用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量合格。100 ℃水浴10 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白10 μg進行10% SDS-PAGE，先以70 V電壓跑膠至Marker膠充分分離，再調(diào)整電壓至120 V，直至電泳結(jié)束，然后將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用5% BSA室溫封閉2 h，分別加入eNOS一抗(稀釋比1∶1 000)、ICAM-1一抗(稀釋比1∶100)、MCP-1一抗(稀釋比1∶1 000)、NF-κB p56一抗(稀釋比1∶1 000)及β-actin一抗(稀釋比1∶3 000)，4 ℃孵育過夜；次日，TBST沖洗10 min×3次，加入相應(yīng)二抗(稀釋比均為1∶5 000)，室溫孵育2 h。TBST沖洗10 min×3次，ECL發(fā)光、顯影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 ROS含量檢測 采用熒光探針法。收集各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h細(xì)胞，接種于24孔板，加入1∶1 000稀釋的ROS陽性對照試劑Rosup，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。吸棄培養(yǎng)液，用無菌PBS徹底清洗3次，加入1∶1 000稀釋的熒光探針DCFH-DA(終濃度10 μmol/L)，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。用無血清的培養(yǎng)液洗滌3次，去除未進入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。倒置熒光顯微鏡下隨機選取含有HRGEC的視野(200倍)，在488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長下觀察細(xì)胞內(nèi)DCF相對熒光單位，根據(jù)相對熒光單位計算細(xì)胞內(nèi)ROS相對含量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活性比較 陰性對照組、生理濃度尿酸組、中濃度尿酸組、高濃度尿酸組細(xì)胞活性分別為0.302±0.035、0.302±0.027、0.295±0.013、0.300±0.036。各組細(xì)胞活性比較P>0.05。

2.2 各組eNOS、ICAM-1、MCP-1、NF-κB p65表達比較 見表1。

表1 各組eNOS、ICAM-1、MCP-1、NF-κB p65 mRNA相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與生理濃度尿酸組比較，#P<0.05。

表2 各組eNOS、ICAM-1、MCP-1、NF-κB p65蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與生理濃度尿酸組比較，#P<0.05。

2.3 各組ROS含量比較 陰性對照組、生理濃度尿酸組、中濃度尿酸組、高濃度尿酸組ROS相對含量分別為1.006±0.000、0.910±0.003、4.746±0.004、7.047±0.003。中濃度尿酸組、高濃度尿酸組ROS相對含量明顯高于陰性對照組、生理濃度尿酸組(P均<0.05)，而陰性對照組與生理濃度尿酸組、中濃度尿酸組與高濃度尿酸組ROS相對含量比較P均>0.05。

3 討論

隨著社會經(jīng)濟發(fā)展，高尿酸血癥的患病率正逐年升高，據(jù)美國國家健康和營養(yǎng)調(diào)查顯示，其患病率較30年前提高了3.2%[3]。臨床研究證實，高尿酸血癥與心血管疾病、代謝綜合征、高血壓等疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[4]。高尿酸水平不僅能導(dǎo)致動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞舒張功能受損，還可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)、激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，引起動脈粥樣硬化。已有研究證實，高尿酸血癥是血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的危險因素之一。但目前高尿酸血癥對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞影響的報道較少，其作用機制尚不完全清楚。

本研究觀察了0、4、8、16 mg/dL尿酸對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各濃度尿酸作用下HRGEC活性無明顯變化，表明尿酸在此濃度范圍內(nèi)無明顯細(xì)胞毒性，可用這些濃度進行后續(xù)實驗。

NO是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的舒張血管因子，由eNOS作用于L-精氨酸生成[5]，在維持腎臟血管張力、調(diào)節(jié)腎臟血壓等方面具有重要作用。但在高尿酸環(huán)境下，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的能力降低，可造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷[6]；同時，高尿酸還可抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，并抑制NO產(chǎn)生。因此認(rèn)為，尿酸有可能是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的介質(zhì)之一[7]。Kang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，尿酸可通過降低eNOS與鈣調(diào)蛋白的結(jié)合，降低精氨酸向NO的轉(zhuǎn)化速率，從而使eNOS活性降低、NO生成減少，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[6]。有研究證實，高尿酸還可導(dǎo)致線粒體內(nèi)Ca2+超負(fù)荷、升高O2-，并通過miR-155下調(diào)eNOS表達，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，進而加重腎損傷[9]。ROS是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，正常狀態(tài)下，ROS具有平衡血管收縮和舒張功能，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞相關(guān)信號通路，維持細(xì)胞正常生長。但高濃度ROS可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[10]。既往研究證實，高濃度尿酸可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致動脈血管壁和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，最終引起動脈粥樣硬化。高尿酸水平下，ROS可激活誘導(dǎo)型NOS，使NO的生物利用度降低，阻斷NO信號通路，從而損害血管舒張功能[11]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中濃度尿酸組、高濃度尿酸組eNOS mRNA與蛋白相對表達量明顯低于陰性對照組、生理濃度尿酸組，而陰性對照組與生理濃度尿酸組、中濃度尿酸組與高濃度尿酸組eNOS mRNA與蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。表明尿酸濃度升高可導(dǎo)致eNOS mRNA和蛋白表達降低，從而引起ROS生成增多，繼而引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

在應(yīng)激狀態(tài)下，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生ICAM-1、MCP-1、NF-κB等炎癥因子或趨化因子[12]。ICAM-1屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族的成員，通過與其受體特異性結(jié)合，使炎癥細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附作用增強，從而參與細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化、炎癥反應(yīng)等病理生理過程。生理狀態(tài)下，ICAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞低表達。羅海清[13]研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化合并高尿酸血癥患者血清CRP、ICAM-1水平較尿酸正常者明顯升高。動物研究亦發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥可引起腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達升高。MCP-1作為一種促炎細(xì)胞因子，可趨化和激活單核細(xì)胞，促進炎癥因子表達[14]。生理條件下，腎小球系膜細(xì)胞MCP-1低表達。當(dāng)MCP-1過表達時，腎小球系膜細(xì)胞可釋放ICAM-1等多種炎癥因子，造成腎組織損傷；過量的MCP-1還可參與氧化應(yīng)激反應(yīng)等途徑，激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集，導(dǎo)致局部組織炎癥級聯(lián)反應(yīng)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞功能[15]。NF-κB是從B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子，能與免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強子B序列GGGACTTTCC特異性結(jié)合，促進κ輕鏈基因表達。迄今共發(fā)現(xiàn)NF-κB2(p52)、NF-κB1(p50)、c-Rel、RelA(p65)、RelB五種NF-κB蛋白家族成員。這些蛋白可通過與多種基因的啟動子和增強子序列位點特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和應(yīng)激反應(yīng)等，還能參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程。有研究已證實，在MCP-1、ICAM-1的基因啟動子存在NF-κB的結(jié)合位點[16]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，高濃度尿酸可激活NF-κB通路，使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、MCP-1過表達[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中濃度尿酸組、高濃度尿酸組ICAM-1、MCP-1、NF-κB p65 mRNA和蛋白相對表達量均明顯低于高于陰性對照組、生理濃度尿酸組，而陰性對照組與生理濃度尿酸組、中濃度尿酸組與高濃度尿酸組ICAM-1、MCP-1、NF-κB p65 mRNA和蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。表明隨著尿酸濃度升高，ICAM-1、MCP-1 mRNA和蛋白表達增加，從而促進內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷；而且NF-κB p65表達上調(diào)與ICAM-1、MCP-1表達上調(diào)一致，由此推測高尿酸對腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與NF-κB經(jīng)典炎癥通路的激活有關(guān)。但生理濃度尿酸組MCP-1、ICAM-1表達與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與以往報道不符，可能與最低尿酸濃度設(shè)定過高或取值單一有關(guān)，后期進一步完善0～4 mg/dL尿酸對炎癥因子表達的影響。

綜上所述，高濃度尿酸可能通過增加氧化應(yīng)激途徑中ROS產(chǎn)生和抑制eNOS表達，以及激活NF-κB信號通路促進炎癥因子分泌等，導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷。