劉濤,張雪竹,賈玉潔,韓景獻(xiàn),聶坤

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,天津300193)

阿爾茨海默病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶障礙、失語(yǔ)、認(rèn)知能力下降，其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[1]。老化是阿爾茨海默病的危險(xiǎn)因素，但并不是所有人在老化過(guò)程中均出現(xiàn)阿爾茨海默病。因此，揭示阿爾茨海默病獨(dú)有的老化模式，有助于闡明老化在阿爾茨海默病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制?；诖髷?shù)據(jù)的系統(tǒng)生物學(xué)分析方法為定性分析阿爾茨海默病的老化模式提供了可能性。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院NIH資助建立的網(wǎng)絡(luò)集成式細(xì)胞內(nèi)特征的公共數(shù)據(jù)(LINCS)項(xiàng)目(http://www.lincsproject.org/)，開發(fā)了Connectivity Map(Cmap)數(shù)據(jù)庫(kù)，收集使用化合物處理和相關(guān)基因干擾劑處理的人類細(xì)胞基因表達(dá)信息。Cmap數(shù)據(jù)庫(kù)包含大量細(xì)胞水平反應(yīng)模式數(shù)據(jù)，同時(shí)開發(fā)了多種系統(tǒng)生物學(xué)分析工具，可從樣品的基因組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行模式化定性分析，揭示某種干預(yù)手段或藥物處理對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)模式的影響及可能機(jī)制[3]。SAMP8小鼠是一種典型的快速老化癡呆小鼠，在成年期即可出現(xiàn)典型伴隨癡呆的快速老化特征，是常用的阿爾茨海默病動(dòng)物模型[4]。2016年1月～2017年12月，我們分析了SAMP8小鼠及SAMR1小鼠海馬組織差異表達(dá)基因，利用LINCS數(shù)據(jù)庫(kù)模式化分析快速老化癡呆小鼠海馬組織差異表達(dá)基因特征，并預(yù)測(cè)老年癡呆的治療藥物?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡(幼年)、8月齡(老年)SAMP8小鼠各20只(雌雄各半)，2月齡(幼年)、8月齡(老年)SAMR1小鼠各20只(雌雄各半)，均由天津中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)SXCK(津)2015-0003]，飼養(yǎng)條件完全相同，自由攝食飲水。芯片雜交使用美國(guó)Affymetrix公司的Affymetrix GeneChip 645 System；芯片信號(hào)掃描使用Affymetrix公司的GeneChip 7G microarray scanner；TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；小鼠基因芯片Affymetrix GeneChip Mouse Transcriptome Array1.0購(gòu)自美國(guó)Affymetrix公司。

1.2 SAMP8、SAMR1小鼠海馬組織差異表達(dá)基因抽提 頸椎脫臼法處死2月齡、8月齡SAMP8和SAMR1小鼠，取海馬組織，置于預(yù)冷的玻璃勻漿器中勻漿，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。每月齡小鼠分別保留3份RNA樣品制作基因芯片(版本號(hào)： Affymetrix GeneChip Mouse Transcriptome Array 1.0)。探針合成、芯片雜交與洗染、芯片掃描、數(shù)據(jù)初步分析均由北京博朗生科技有限公司完成。采用LINCS(http://lincs-dcic.org/)項(xiàng)目下GEO2Enrichr在線分析工具抽提和分析差異表達(dá)基因。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法選擇Characteristic Direction，以3個(gè)幼年SAMP8小鼠海馬組織芯片作為對(duì)照，從3個(gè)老年SAMP8小鼠芯片數(shù)據(jù)中抽提具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因(校正P<0.05)。同樣方法抽提SAMR1老年小鼠具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異表達(dá)基因。

1.3 快速老化相關(guān)基因GO富集、KEGG代謝途徑分析 將上述差異表達(dá)基因?qū)敫患治龉ぞ逧nrichr進(jìn)行生物信息學(xué)分析。對(duì)差異表達(dá)快速老化基因進(jìn)行GO富集分析，揭示其主要細(xì)胞定位、分子功能，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用KEGG代謝途徑分析差異表達(dá)快速老化基因的功能及代謝通路。

1.4 差異表達(dá)快速老化相關(guān)基因模式定性分析及治療藥物預(yù)測(cè) 使用LINCS項(xiàng)目下CREEDS網(wǎng)絡(luò)在線分析工具對(duì)差異表達(dá)快速老化基因模式進(jìn)行定性分析，查詢與未知樣本基因表達(dá)特征模式有相似或相反特征的LINCS數(shù)據(jù)庫(kù)中已知表達(dá)模式[5]，采用小分子藥物模塊定性分析預(yù)測(cè)老年性癡呆的治療藥物。

2 結(jié)果

2.1 SAMP8、SAMR1小鼠海馬組織差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 伴隨快速老化過(guò)程，SAMP8小鼠海馬組織表達(dá)上調(diào)基因808個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因186個(gè)；伴隨正常老化過(guò)程，SAMR1小鼠海馬組織表達(dá)上調(diào)基因306個(gè)、表達(dá)下調(diào)基因599個(gè)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SAMP8小鼠海馬組織基因表達(dá)模式以上調(diào)為主要特征，SAMR1小鼠海馬組織基因表達(dá)模式以下調(diào)為主要特征，二者共有61個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和68個(gè)表達(dá)下調(diào)基因。SAMP8小鼠海馬組織快速老化基因表達(dá)模式中，去掉共有基因，還有747個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和245個(gè)表達(dá)下調(diào)基因具有特異性。

2.2 快速老化基因GO功能富集分析結(jié)果 表達(dá)上調(diào)基因中多個(gè)富集詞條具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，747個(gè)表達(dá)上調(diào)基因轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)后主要定位于細(xì)胞質(zhì)核糖體和線粒體，見表1；主要生物學(xué)過(guò)程是細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成分選、定位以及病毒核酸合成，見表2；主要分子功能是NADH 還原酶活性(NADH dehydrogenase activity,GO:0008137,校正P=3.138E-6)；245個(gè)表達(dá)下調(diào)基因分析結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SAMR1基因表達(dá)模式中，去掉共有基因，共有118個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和531個(gè)表達(dá)下調(diào)基因具有特異性，GO功能富集分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)、下調(diào)基因差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 SAMP8小鼠海馬組織表達(dá)上調(diào)基因細(xì)胞內(nèi)定位的GO功能富集分析結(jié)果

表2 SAMP8小鼠海馬組織表達(dá)上調(diào)基因生物學(xué)過(guò)程的GO功能富集分析結(jié)果

2.3 快速老化相關(guān)基因KEGG代謝途徑分析結(jié)果 見表3。SAMP8小鼠海馬組織基因表達(dá)模式中，747個(gè)表達(dá)上調(diào)基因有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)途徑，主要為線粒體氧化磷酸化途徑、3種神經(jīng)退行性疾病代謝途徑(阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病)、核糖體蛋白質(zhì)合成途徑及非酒精性脂肪肝、大腸桿菌感染代謝網(wǎng)絡(luò)途徑；245個(gè)表達(dá)下調(diào)基因分析結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SAMR1小鼠海馬組織基因表達(dá)模式中，118個(gè)表達(dá)上調(diào)基因和531個(gè)表達(dá)下調(diào)基因的KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)途徑差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 SAMP8小鼠海馬組織表達(dá)上調(diào)基因的KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)途徑分析結(jié)果

2.4 快速老化相關(guān)差異表達(dá)基因模式定性分析結(jié)果 單基因模塊定性分析結(jié)果顯示，與SAMP8小鼠基因表達(dá)模式匹配度排名靠前的單基因模塊是Psap(GEO ID：GSE8307)；與SAMR1小鼠基因表達(dá)模式相似度最高的單基因模塊是Pink1(GEO ID：GSE60413)。結(jié)果表明，SAMP8小鼠海馬組織對(duì)快速老化產(chǎn)生的反應(yīng)模式與Psap 基因過(guò)表達(dá)的反應(yīng)模式匹配度最高，而SAMR1小鼠則與Pink1基因過(guò)表達(dá)的反應(yīng)模式匹配度最高。

2.5 快速老化相關(guān)差異表達(dá)基因治療藥物預(yù)測(cè)結(jié)果 小分子藥物模塊定性分析結(jié)果顯示，與SAMP8小鼠基因表達(dá)模式匹配度最高的小分子藥物模塊是煙酰胺核糖(維生素PP，GEO ID：GSE62194)；與SAMR1小鼠基因表達(dá)模式匹配度最高的小分子藥物模塊是Deltamethrin(GEO ID：GSE7955)。結(jié)果表明，維生素PP能模擬SAMP8小鼠海馬組織細(xì)胞的基因表達(dá)模式，理論上可用于快速老化相關(guān)癡呆的治療藥物。

3 討論

老化過(guò)程中細(xì)胞各項(xiàng)生理活動(dòng)都處于逐漸衰退狀態(tài)，各種功能基因的表達(dá)逐漸降低[6]。在SAMR1小鼠海馬組織中快速老化基因轉(zhuǎn)錄水平降低，表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于表達(dá)上調(diào)基因。但SAMP8小鼠的快速老化模式與SAMR1小鼠正常老化模式明顯不同，SAMP8小鼠海馬組織中快速老化基因表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)目遠(yuǎn)多于下調(diào)基因。上述結(jié)果表明，癡呆相關(guān)快速老化過(guò)程存在異常活躍的基因轉(zhuǎn)錄。

SAMR1小鼠海馬組織中上調(diào)與下調(diào)基因散在、無(wú)序，因而在GO生物信息學(xué)分析和KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)途徑分析中，無(wú)論是表達(dá)上調(diào)基因還是表達(dá)下調(diào)基因，均未出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果；SAMP8小鼠海馬組織表達(dá)上調(diào)基因的GO分析和KEGG代謝途徑分析結(jié)果均表現(xiàn)出明顯集中性和富集特征，表達(dá)上調(diào)基因的細(xì)胞定位主要是核糖體和線粒體，表明大量的線粒體相關(guān)蛋白質(zhì)在核糖體翻譯合成；主要生物學(xué)功能是細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成分選、定位，表明很多基因參與新合成的線粒體蛋白質(zhì)從核糖體轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體過(guò)程；主要分子功能是NADH還原酶活性，表明有很多快速老化基因參與線粒體氧化磷酸化過(guò)程[7]。線粒體相關(guān)基因高表達(dá)是細(xì)胞修復(fù)受損線粒體應(yīng)激反應(yīng)的主要特征。GO生物信息學(xué)分析結(jié)果提示，SAMP8小鼠癡呆相關(guān)的基因表達(dá)模式是一種特殊的細(xì)胞線粒體修復(fù)模式。KEGG代謝網(wǎng)絡(luò)途徑分析結(jié)果也支持這個(gè)觀點(diǎn)。SAMP8小鼠海馬組織表達(dá)上調(diào)基因涉及的關(guān)鍵代謝網(wǎng)絡(luò)途徑中，排在首位的是線粒體氧化磷酸化代謝途徑[8]，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝途徑還包括核糖體蛋白質(zhì)合成途徑以及3種神經(jīng)退行性疾病代謝途徑，表明SAMP8小鼠癡呆相關(guān)的基因表達(dá)模式具有典型的神經(jīng)退行性疾病模式特征。

CREEDS分析工具的模擬效應(yīng)模式定性分析結(jié)果顯示，SAMR1小鼠海馬組織快速老化基因表達(dá)模式類似于Pink1基因過(guò)表達(dá)模式。Pink1是一種蛋白激酶，能在身體任何細(xì)胞中表達(dá)，在大腦等耗能高的器官中表達(dá)尤為突出。在神經(jīng)元內(nèi)，主要位于線粒體內(nèi)膜，Pink1可觸發(fā)線粒體自噬過(guò)程，是線粒體功能衰退的標(biāo)志[9]。這表明正常老化模式是一種以線粒體功能衰退為特征的模式。SAMP8小鼠海馬組織快速老化模式則類似Psap基因過(guò)表達(dá)模式。Psap基因過(guò)表達(dá)模式是一種典型的神經(jīng)元保護(hù)模式。Psap是一種鞘脂激活蛋白原(Prosaposin)，也是一個(gè)高度保守的糖蛋白。在神經(jīng)系統(tǒng)中，分泌型Prosaposin是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和髓鞘營(yíng)養(yǎng)因子, 其鞘脂激活蛋白C區(qū)的N末端14個(gè)氨基酸殘基具有營(yíng)養(yǎng)活化功能；腦損傷后,Prosaposin過(guò)表達(dá)具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的雙重特性[10]。結(jié)果提示，與正常老化的線粒體功能衰退模式不同，快速老化模式以神經(jīng)元保護(hù)功能為主要特征。

小分子藥物模塊定性分析結(jié)果提示，線粒體在癡呆小鼠生物學(xué)機(jī)制具有關(guān)鍵作用。維生素PP是人體13種必需維生素之一。煙酸在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺，煙酰胺是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，組織呼吸的氧化過(guò)程和糖類的無(wú)氧分解過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，維生素PP可促進(jìn)線粒體電子傳遞鏈蛋白表達(dá)，提高線粒體膜電位，提高氧化呼吸率和細(xì)胞內(nèi)ATP水平，促進(jìn)線粒體再生[11]。維生素PP能增強(qiáng)線粒體的功能，最終抑制細(xì)胞衰老[12]。腦組織維生素PP消耗約占全身的70%。煙酰胺核苷對(duì)快速老化癡呆小鼠潛在的治療作用提示，線粒體在癡呆發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

綜上所述，SAMP8小鼠海馬組織的基因表達(dá)模式以神經(jīng)元保護(hù)為主要特征，是一種特殊的細(xì)胞線粒體修復(fù)模式，其線粒體相關(guān)基因表達(dá)顯著上調(diào)；主要作用靶點(diǎn)是細(xì)胞線粒體的維生素PP可能是老年性癡呆的有效治療藥物。