徐兆坤，李 武，王玉炯*

(1.寧夏大學西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川 750021；2.寧夏大學生命科學學院，銀川 750021)

結(jié)核病(tuberculosis)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)感染引起的人畜共患傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，2015年，全球新增Mtb感染人數(shù)1 040萬，死亡人數(shù)140萬，另有40萬人死于Mtb和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的雙重感染[1]。結(jié)核病的流行范圍之廣，危害之大，嚴重影響著人類公共衛(wèi)生安全。然而，由于結(jié)核病的致病機制十分復(fù)雜，結(jié)核病的預(yù)防和治療工作仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。所以，深入探究結(jié)核病的致病機制與機體抵抗結(jié)核病的免疫機制，實現(xiàn)結(jié)核病防治領(lǐng)域的重大突破，對減少因感染Mtb對人類健康帶來的危害，具有至關(guān)重要的作用。另外，建立適當?shù)慕Y(jié)核病預(yù)防診斷和治療的新方法也具有十分重要的現(xiàn)實意義。

外泌體是一種由細胞衍生的囊泡類結(jié)構(gòu)，最早發(fā)現(xiàn)于20世紀80年代中期，開始時它是指在網(wǎng)織紅細胞成熟期間出芽產(chǎn)生的小囊泡，有清除多余膜結(jié)合蛋白的作用[2]。所以外泌體最初被認為是細胞的“廢棄物”，并未受到太多關(guān)注。然而后來有研究發(fā)現(xiàn)，這些小的胞外分泌泡并非只由網(wǎng)織紅細胞特異分泌，大多數(shù)哺乳動物細胞都可以釋放這種膜泡[3]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)外泌體在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色，在機體的免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。近年來，越來越多的研究也發(fā)現(xiàn)，外泌體與Mtb的感染密切相關(guān)，本文將就外泌體在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展及診療中的作用進行綜述。

1 外泌體

外泌體(exosomes)是一種由細胞衍生的囊泡類結(jié)構(gòu)，其體積很小，直徑僅40～200 nm。外泌體可以由多種類型的細胞分泌，并可以從幾乎所有體液中分離出來，包括尿液、血漿、母乳、支氣管肺泡灌洗液、唾液、精液、羊水、腹水、關(guān)節(jié)液、母乳和腦脊髓液等[4-5]。外泌體內(nèi)部包含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA等多種分子。目前已經(jīng)在不同物種的外泌體中鑒定出了4 563種蛋白質(zhì)，194種脂質(zhì)，1 639種mRNA和764種miRNA，其中膜轉(zhuǎn)運蛋白和融合蛋白是最常見的。還有一些外來蛋白質(zhì)是外泌體共有的，其中包括四跨膜蛋白超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF)、CD63、CD81、CD9和熱休克蛋白(Hsp70)，這些蛋白質(zhì)通?？梢杂米魍饷隗w的標記物[6]。Mtb感染宿主細胞后，可以從外泌體中分離得到完整的分枝桿菌蛋白，包括Ag85B、HspX和許多其他分枝桿菌蛋白[3]?？ń槊?Bacille Calmette-Guérin, BCG)感染人單核細胞源性巨噬細胞(human monocyte-derived macrophages, MDMs)后，可以誘導其釋放外泌體，該外泌體中含有多種類型的miRNA[7-8]。2015年，Lee等[9]用LC-MS/MS技術(shù)從Mtb感染細胞分泌的外泌體中檢測到了287個蛋白，并發(fā)現(xiàn)其中有些與Mtb毒性有關(guān)。外泌體在生物液體中高度穩(wěn)定，同時還包含各種與機體生理狀態(tài)相關(guān)的分子特征，因此可以通過提取外泌體分子內(nèi)含物來獲得大量關(guān)于細胞生理和病理狀態(tài)的信息[10-11]。

隨著研究的不斷深入，外泌體的各種生物學功能開始為人所知。許多研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以通過各種分子(包括從供體到受體細胞的miRNA)的往復(fù)傳遞而參與細胞間通訊[11]。由外泌體運送到靶細胞的外來miRNA可以顯著地影響靶細胞和受體細胞內(nèi)的生化反應(yīng)，從而影響細胞功能和病理狀態(tài)的發(fā)展。隨著研究的深入，人們開始意識到外泌體在免疫調(diào)節(jié)和細胞治療中發(fā)揮作用[12]。它們甚至可以作為疫苗載體在抗Mtb感染中發(fā)揮作用[13]。

2 外泌體在結(jié)核分枝桿菌感染中的作用

在外泌體日益引起廣泛關(guān)注的同時，越來越多的研究者開始將目光聚焦在結(jié)核病與外泌體之間的關(guān)系上。外泌體來源廣泛，內(nèi)含物種類多樣，是獲取結(jié)核病病理信息的極佳來源。因此外泌體在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展中的作用吸引著越來越多科學家的關(guān)注。從目前的研究進展來看，外泌體在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中的作用總體來說有以下幾個方面。

2.1 提呈抗原信息

外泌體可以作為病原分子學模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)的載體，通過沉默或促進免疫應(yīng)答進而影響受體細胞的生理狀態(tài)。早在1994年，科學家就發(fā)現(xiàn)了分枝桿菌在不同的細胞膜泡內(nèi)運輸細菌內(nèi)含物的現(xiàn)象，結(jié)果顯示釋放的囊泡具有將結(jié)核菌成分轉(zhuǎn)移到相鄰的未感染的巨噬細胞的能力[14]。Wang等[15]比較了巨噬細胞分泌的外泌體和用鳥分枝桿菌感染巨噬細胞后分泌的外泌體的成分，結(jié)果顯示，兩者外泌體中蛋白成分存在顯著的差異，后者兩種β-肌動蛋白亞型有所下調(diào)，而絲切蛋白(cofilin-1)上調(diào)。其研究結(jié)果還表明鳥分枝桿菌感染的巨噬細胞分泌的外泌體可能是鳥分枝桿菌抗原組分的載體，后者攜帶誘導促炎反應(yīng)的分子糖肽脂，是細胞外抗原的重要來源。

Ramachandra等[16]研究證實，Mtb感染巨噬細胞后，巨噬細胞分泌的外泌體和囊泡中含有MHC-Ⅱ類分子，它們可以將抗原信息提呈給T細胞，并且它們可能比天然T細胞更有效地刺激記憶或活化的T細胞。這些機制可使結(jié)核分枝桿菌感染細胞分泌的囊泡運輸至離感染細胞更遠距離的細胞位點，并在這些位點刺激相關(guān)的T細胞發(fā)揮作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，在Mtb感染的細胞所分泌的外泌體中宿主熱休克蛋白70(Hsp70)特異性增加[3, 17]，增加的Hsp70不僅可以促進細胞發(fā)生炎性反應(yīng)，還可以加強巨噬細胞對恥垢分枝桿菌以及對鳥分枝桿菌的殺傷作用。這表明外泌體中除了含有外來抗原成分外，還含有宿主成分，說明外泌體在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展過程中，可以作為媒介在細胞間傳遞抗原信息，促進Mtb抗原的提呈[18]，對結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展起著不可忽視的作用，但是與其他抗原呈遞機制相比，外泌體介導的抗原遞送以及激活免疫反應(yīng)的機制需要進一步研究。

2.2 激活免疫細胞

除了具有提呈抗原的作用外，在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程中，外泌體還具有激活免疫細胞的作用。帶有分枝桿菌成分的外泌體具有激活巨噬細胞的能力。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，鳥分枝桿菌和鳥分枝桿菌感染的巨噬細胞分泌的外泌體均可增強巨噬細胞中CD80和CD86的表達以及TNF-α和IFN-γ的分泌，可以引起靜息巨噬細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。隨后的研究進一步證實，從鳥分枝桿菌感染的巨噬細胞提取外泌體刺激巨噬細胞后，能增強巨噬細胞對葡聚糖的吞噬能力和巨噬細胞中CD40、CD80、CD81、CD86、HLA-DR，尤其CD195的表達，同時也能增強巨噬細胞中IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ和TNF-α的分泌[19]，說明外泌體具有活化巨噬細胞的作用。不僅如此，更多的研究還證實，外泌體還可以激活CD4+和CD8+T細胞，對獲得性免疫應(yīng)答的形成具有重要作用[16]。Smith等[20]還發(fā)現(xiàn)被Mtb感染的小鼠巨噬細胞釋放的外泌體可以顯著影響T細胞應(yīng)答，這意味著外泌體不僅可以在Mtb感染期間向免疫細胞呈遞抗原信息，還可以介導免疫系統(tǒng)的激活。Giri等[21]以J774為細胞模型，用Mtb刺激巨噬細胞后分離巨噬細胞分泌的外泌體，用LC-MS/MS從中鑒定出了41種Mtb抗原，包括許多眾所周知的Mtb抗原，包括抗原85A、B和C(Rv3804c，Rv1886c，Rv0129c)，MPT64(Rv1980c)和ESAT-6(Rv3875)，并用其中部分分泌性抗原刺激J774細胞，分離外泌體，體外試驗結(jié)果顯示，這些外泌體具有激活巨噬細胞、樹突狀細胞和初始CD4+和CD8+細胞的能力[21-22]。以上研究證實，外泌體對多種免疫細胞具有激活和活化作用，在宿主抵抗Mtb感染的過程中有著不可低估的影響。

2.3 調(diào)控機體免疫反應(yīng)

除了提呈抗原和激活免疫細胞外，外泌體在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程中可能還發(fā)揮其他作用。被Mtb感染的巨噬細胞所釋放的外泌體對保護性細胞免疫應(yīng)答可能存在一定的抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Mtb感染巨噬細胞后，巨噬細胞分泌的外泌體可以阻礙天然巨噬細胞的INF-γ途徑的激活，抑制小鼠巨噬細胞表面MHC Ⅱ類和CD64分子的表達，這種抑制作用主要依賴于Toll樣受體2(TLR2)和髓樣分化因子88(MyD88)參與完成，從而對機體抗Mtb感染免疫產(chǎn)生一定的負面影響[23]。

還有研究發(fā)現(xiàn)，用BCG感染人單核細胞源性巨噬細胞(MDMs)可導致多種miRNA的釋放，主要包括Let-7家族成員，miR-155、miR-146a、miR-145和miR-21。這些miRNA都被預(yù)測為與免疫相關(guān)的重要靶向基因[24]。與未感染細胞相比，被Mtb感染的巨噬細胞分泌的外泌體中miRNA的含量有顯著變化，后者內(nèi)含物中與psmb9、psmd3、psme2、cd74以及l(fā)gmn相關(guān)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平明顯更高。除此之外在被Mtb感染后的巨噬細胞所得到的外泌體中還檢測到多種Mtb的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，包括Rv0740、Rv0288、Rv1344、Rv0968、Rv1942c、Rv0664、Rv0190、Rv1757c和Rv1369c。這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)移到其他細胞中并能正常翻譯成蛋白質(zhì)。并且這些RNA可能參與受體細胞中免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)并誘導受體細胞的細胞凋亡[25]。結(jié)核病的病變特征是形成典型的結(jié)核性肉芽腫，含有免疫原的外泌體可以被巨噬細胞和周圍的免疫細胞攝取，通過這種方式抑制IFN-γ途徑的激活，這有利于將Mtb擴散到未感染的細胞，這也就可以解釋長期觀察到的宿主細胞廣泛參與肉芽腫的現(xiàn)象[26]。以上研究說明，外泌體在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程中，對宿主細胞還起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展過程中，外泌體可以作為媒介在細胞間傳遞細胞因子，促進Mtb抗原的提呈，外泌體還對多種免疫細胞具有激活和活化作用，尤其是對巨噬細胞的活化發(fā)揮重要的作用。當然，外泌體對免疫細胞的作用也不完全體現(xiàn)在對免疫細胞的激活上，還存在復(fù)雜的免疫調(diào)控作用，這說明外泌體在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展的過程中作用的復(fù)雜性。

3 外泌體可作為結(jié)核病診斷中潛在的生物標志物

生物標志物(biomarker)是指可以檢測系統(tǒng)、器官、組織、細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)或功能的改變或可能發(fā)生改變的生化指標，它有助于對疾病發(fā)病狀況進行診斷評估。外泌體來源廣泛，內(nèi)含物種類多樣，是獲取生物標志物的極佳來源，可以用于疾病的檢測，監(jiān)視疾病的發(fā)展狀況[27]。結(jié)核病生物標志物的研究進展緩慢[28-30]。目前作為結(jié)核病常用的診斷方法主要有痰涂片顯微鏡方法檢查抗酸桿菌(acid fast bacilli, AFB)和結(jié)核菌素皮膚測試(tuberculin skin test, TST)等方法，雖然這些方法可行，但在檢測診斷的速度和精準度上均有所欠缺。因此開發(fā)新的生物標志物用于結(jié)核病的快速、精準診斷是十分必要的。由于外泌體諸多方面的優(yōu)點，越來越多的報道開始把外泌體及其內(nèi)含物當作一些難以直接檢測的細胞或器官的疾病生物標志物[31]。

3.1 外泌體miRNA可作為生物標志物

2000年Beatty等[32]發(fā)現(xiàn)外泌體中含有病原體衍生的抗原，被感染細胞釋放的外泌體攜帶多種可以作為特定感染因子的病原衍生分子[33]，例證了外泌體在傳染病診斷中的潛在應(yīng)用價值。基于現(xiàn)有證據(jù)，各種類型的細胞產(chǎn)生的外泌體在調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，在各種肺部疾病的發(fā)病機制中也扮演了重要角色[34]。因此，外泌體在結(jié)核病診斷研究中越來越受到關(guān)注，在早期診斷和預(yù)防中有著極為廣闊的應(yīng)用前景。首先，miRNA可以作為潛在的生物標志物用于結(jié)核病的快速診斷。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體中的miRNA譜與其供體細胞炎癥狀態(tài)有關(guān)[35-36]。Mortaz等[8]研究發(fā)現(xiàn)，BCG感染人單核細胞源性巨噬細胞(MDMs)后，導致許多miRNA的釋放，所有這些miRNA都被預(yù)測為重要的免疫相關(guān)靶向基因。Lin等[37]通過高通量測序檢測了肺炎、肺結(jié)核和肺癌患者胸腔積液中miRNA表達模式，并從肺炎和肺結(jié)核患者胸腔積液中檢測到了3個差異表達的miRNA，從肺炎和肺癌患者胸腔積液中檢測到27個差異表達的miRNA，其中miR-378i僅在肺結(jié)核患者胸腔積液中有顯著變化。當然，目前多數(shù)研究只是在現(xiàn)有研究結(jié)果的基礎(chǔ)上推測外泌體中的miRNA有作為生物標志物用于診斷結(jié)核病的潛能，但目前并無相關(guān)miRNA作為生物標志物用于結(jié)核病的快速診斷中[25, 37-39]，因此，這方面的研究仍需深入開展。

3.2 外泌體蛋白可作為生物標志物

除了miRNA，在結(jié)核病快速診斷分子標志物的篩選中，Mtb抗原蛋白或者多肽片段也是重要的候選生物標志物。Mtb是典型的胞內(nèi)寄生菌，從外泌體中尋找其分子標記具有重要意義。已有大量的研究證實，Mtb或牛分枝桿菌感染宿主細胞后釋放的外泌體含有病原體衍生抗原[22, 40]，而且其中不乏免疫原性很強的諸如ESAT6(Rv3875)、Ag85復(fù)合物(Rv3804c、Rv1886c和Rv0129c)、MPT64(1980c)和MPT63(1926c)等抗原[17, 22]。也有研究從結(jié)核病患者血清中分離出的外泌體中鑒定出了多種結(jié)核菌蛋白，包括Ag85B、BfrB、GlcB和Mpt64等[40]。Mehaffy等[41]也從結(jié)核病患者血清中分離的外泌體中檢測到了41個Mtb多肽分子，并證實其中的Cfp2、Mpt32、Mpt64 和BfrB在活動性結(jié)核病患者血清中的含量很高。Kruh-Garcia等[40]用MRM-MS技術(shù)從活動性結(jié)核病人和潛伏期結(jié)核病人血清外泌體中也檢測到了大量的源于Ag85B、Ag85C、Apa、BfrB、GlcB、HspX、KatG和Mpt64的多肽片段。此外，還可以根據(jù)血清中的外來標志物(如MPT64)區(qū)分肺內(nèi)和肺外結(jié)核，并識別活動性和潛伏性疾病。這種檢測潛在感染性疾病的能力是十分重要的，這在一定程度上可以降低傳染病的傳播風險。這些研究表明外泌體中的蛋白成分也可以作為生物標志物用于診斷結(jié)核病。

目前，外泌體在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究方面已經(jīng)取得了實質(zhì)性的進展。Diaz等[42]發(fā)現(xiàn)Mtb感染可導致外泌體蛋白質(zhì)組成的顯著變化，他們使用新的生物素標記策略對這些蛋白質(zhì)在外泌體膜中進行定位，結(jié)果表明，Mtb可能影響宿主細胞的變化，這可能被用作結(jié)核病生物標志物用于檢測結(jié)核病。另外，研究發(fā)現(xiàn)，體液中外泌體的數(shù)量和含量可能隨疾病而顯著變化，循環(huán)外泌體的數(shù)量增加可能與肺部的疾病進展相關(guān)[43]。Schorey和Dobos[44]建立了一種快速檢測Mtb蛋白質(zhì)以鑒定活動性結(jié)核病患者的方法，這項研究為外泌體在診斷結(jié)核病的應(yīng)用作出了進一步的貢獻。

基于以上的研究我們不難發(fā)現(xiàn)，外泌體在結(jié)核病診斷中是一種具有很高潛在應(yīng)用價值的分子標志物。雖然目前外泌體與結(jié)核病之間的具體關(guān)系并未研究透徹，但是不難想象，在不久的將來，將會不斷有新的分子標志物被發(fā)現(xiàn)。需要指出的是，目前也沒有直接的證據(jù)來證明這些蛋白或多肽可以作為生物標志物用于結(jié)核病的快速診斷中。

4 外泌體在結(jié)核病疫苗開發(fā)中的應(yīng)用

目前，BCG仍然是預(yù)防結(jié)核病的唯一商業(yè)化疫苗。雖然在全球范圍內(nèi)正在開發(fā)的結(jié)核病疫苗很多，也有一部分已經(jīng)進入了臨床試驗階段，但這些疫苗還無法滿足臨床理想的要求。外泌體是許多生理過程的重要調(diào)節(jié)因子，包括組織體內(nèi)平衡、免疫刺激或免疫抑制等。從抗原提呈細胞釋放的外泌體包含MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和CD86，并且可以刺激機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答[45-46]。研究發(fā)現(xiàn)，來源于樹突狀細胞的外泌體可以誘導非常強的免疫應(yīng)答[47]。含有HSP70的外泌體可以通過激活自然殺傷細胞(NKs)和巨噬細胞來達到促炎的效果[48]。Koyama等[49]用編碼Mtb抗原早期分泌抗原靶標-6(6-kDa early secretory antigenic target, ESAT-6)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16黑素瘤細胞并收集其分泌的外泌體，當該外泌體被注射到小鼠體內(nèi)時，可以顯著誘發(fā)針對ESAT-6的細胞免疫應(yīng)答，說明含有Mtb抗原(或其表位)的外泌體具有作為結(jié)核病疫苗的潛力，這為結(jié)核病疫苗的研究開發(fā)提供了一條新思路。還有研究發(fā)現(xiàn)Mtb培養(yǎng)物濾液蛋白(culture filtrate protein, CFP)處理后的巨噬細胞釋放的外泌體能夠激活機體的先天性和獲得性免疫應(yīng)答，由于不需要用活毒菌株進行處理，這種CFP處理巨噬細胞產(chǎn)生的外泌體很容易制備[21, 50]，可能是很好的疫苗材料。值得一提的是，Cheng和Schorey[50]觀察到含有泛素化標簽重組抗原的外泌體可有效地引發(fā)T細胞應(yīng)答。另外，Smith等[51]發(fā)現(xiàn)，泛素化作用在Mtb抗原從細胞進入外泌體的過程中發(fā)揮重要作用。這表明基于泛素化的外泌體蛋白遞送策略可以為防治肺結(jié)核病提供一種獨特的方法來產(chǎn)生具有潛力的新型疫苗。

目前，外泌體與抗Mtb疫苗領(lǐng)域的研究不斷有新的發(fā)現(xiàn)。雖然外泌體作為結(jié)核病疫苗仍存在一些問題，比如外泌體引起特異性免疫的抗原還未全面了解；外泌體攜帶的各種抗原在機體免疫中的具體機制尚不明確等，但是整體來說外泌體仍是結(jié)核病治療策略分析設(shè)計的理想資源。它們易于純化，并富含分枝桿菌的多種產(chǎn)物，比如蛋白質(zhì)、分枝桿菌脂質(zhì)和RNA等[52-54]。它們在感染期間的持續(xù)性和炎癥過程中變化，都可以為疫苗的開發(fā)提供思路。我們有理由相信外泌體能夠成為一種新型抗結(jié)核病疫苗并得到廣泛的應(yīng)用。

5 結(jié)論及展望

外泌體的發(fā)現(xiàn)對人類認識機體生理、病理的方式產(chǎn)生了重要影響，有很多生物醫(yī)學相關(guān)的生化和分子生物學的研究在外泌體分析的層面上都可以開拓一個新的思路。Mtb感染宿主細胞后，宿主細胞分泌的外泌體中含有多種Mtb抗原成分，這些抗原可以有效地激發(fā)宿主產(chǎn)生先天性免疫和獲得性免疫應(yīng)答，從這個意義上說，外泌體是抗結(jié)核疫苗有效的載體。在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過程中，外泌體可以作為載體向免疫細胞提呈抗原，也能有效地激活諸如巨噬細胞、T細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞，當然也能抑制部分免疫細胞的功能，起到復(fù)雜的免疫調(diào)控作用。目前結(jié)核病的免疫機制，尤其是結(jié)核病病原菌逃避宿主細胞免疫監(jiān)視和清除的機制研究尚未有重大的理論突破。因此深入研究外泌體對免疫細胞的復(fù)雜調(diào)控機制，將有助于闡明宿主抗結(jié)核免疫的分子機制以及Mtb逃逸宿主殺傷的免疫逃逸機制，對結(jié)核病的快速診斷、新型抗結(jié)核病藥物和疫苗的開發(fā)等具有一定的理論和現(xiàn)實意義。希望不久的將來，關(guān)于外泌體在結(jié)核病領(lǐng)域的研究能幫助人們在結(jié)核病研究中取得重大的突破。