張萬(wàn)有

（青海省海東市樂(lè)都區(qū)農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法大隊(duì)，青海 海東 810799）

輪狀病毒是哺乳類動(dòng)物中一種常見(jiàn)的感染性病毒，不僅感染動(dòng)物，也能引發(fā)嬰幼兒及成人的急性腹瀉，嚴(yán)重腹瀉的患者還會(huì)出現(xiàn)脫水等嚴(yán)重不良反應(yīng)，對(duì)身體造成極大的危害。為了提高臨床治療的效果，本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了牛初乳對(duì)輪狀病毒的抵抗效果。

1 牛初乳抗輪狀病毒概況

輪狀病毒是雙鏈核糖核酸病毒，由11個(gè)RNA片段組成，形狀主要以球形為主，其直徑為60～80nm，具有雙層核衣殼，內(nèi)層主要呈現(xiàn)放射狀排列，形似車輪的線條，故稱輪狀病毒。牛初乳是奶牛分娩后3d內(nèi)所產(chǎn)生的乳汁，乳汁中含有許多免疫因子，包括五大免疫球蛋白（Ig）、乳鐵蛋白、特異性抗體等，免疫球蛋白能夠與病原微生物、毒素等抗原結(jié)合，促進(jìn)嬰幼兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育，抑制病毒感染人體?，F(xiàn)代《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》也證實(shí)牛初乳具有增加免疫力、改善生長(zhǎng)發(fā)育能力以及改善胃腸道功能的作用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)材料

（1）試驗(yàn)組 選用過(guò)濾除菌的牛初乳，將其分裝，放入4℃的冰箱中備用；（2）對(duì)照組 選用利巴韋林片作為對(duì)照藥物（陽(yáng)性）。（3）細(xì)胞 主要為MA-104細(xì)胞株；（4）病毒 主要為WA株輪狀病毒；（5）試驗(yàn)動(dòng)物 選取輪狀病毒陰性實(shí)驗(yàn)小鼠，雌雄小鼠放在同一籠中讓其自然受孕以及分娩。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將選取的MA-104細(xì)胞置于水浴中融化（37℃），然后離心大約2～3min，將凍存液倒去，放入細(xì)胞培養(yǎng)液，標(biāo)記后將其放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，如果細(xì)胞正常生長(zhǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，待其生長(zhǎng)充滿培養(yǎng)時(shí)，將培養(yǎng)液舍棄，加入磷酸緩沖鹽溶液清洗2～3次，然后加入0.25%的胰酶消化，靜置一段時(shí)間后如果細(xì)胞脫落，則需將胰酶析出再加入培養(yǎng)液，待其混合均勻后測(cè)定細(xì)胞的數(shù)量及濃度，加入96或48孔板中留存。加入磷酸緩沖鹽溶液清洗2～3次，將輪狀病毒加入培養(yǎng)瓶中，待其完全留存在瓶中后將輪狀病毒液體舍棄，然后將2%血清DMEM（4mL）加入到培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記后將其放入培養(yǎng)箱中，每日觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)變化以及異常，待MA-104細(xì)胞皆表現(xiàn)為陽(yáng)性，然后將培養(yǎng)瓶置于-80℃冰箱中凍存（20～30min），然后-80℃～-20℃～4℃逐層解凍，反復(fù)凍融3次，然后離心大約20min左右，取上層清液為病毒液，分裝后將其放入-80℃保存。2%DMEM將病毒稀釋,濃度包括0.1/0.01/0.001……10-10，然后將每個(gè)濃度的病毒液接種于96孔中，每個(gè)孔100μL，每個(gè)濃度三個(gè)孔，并設(shè)置空白對(duì)照以及正常細(xì)胞對(duì)照組，將其放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，將病毒液舍棄，然后再在每孔中加入2%DMEM維持細(xì)胞液200μL，放入培養(yǎng)箱，隔斷時(shí)間就需觀察，到最低稀釋度的病毒孔無(wú)變化后，對(duì)出現(xiàn)的CPE細(xì)胞孔數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)算病毒的滴度。

2.3 動(dòng)物試驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為6組，分別為正常組、模型組（接種病毒組）、陽(yáng)性對(duì)照組（利巴韋林）、牛初乳高劑量組、牛初乳中劑量組、牛初乳聯(lián)合利巴韋林組。分娩后5d的小鼠通過(guò)接種病毒液，正常組接種正常細(xì)胞培養(yǎng)液。正常組和模型組給予生理鹽水，其余幾組給予不同濃度的藥液，連續(xù)給藥1周，每天觀察小鼠的糞便、脫水、體重等情況。將小鼠處死后將其幽門到回盲部小腸取出，固定制片進(jìn)行顯微鏡下病理檢測(cè)。

3 研究結(jié)果

在出生5d后測(cè)定小鼠的體重沒(méi)有明顯差異性，感染病毒后，正常組體重增長(zhǎng)未出現(xiàn)異常；模型組（接種病毒組）的體重增長(zhǎng)慢，在1～4d中，牛初乳中劑量組體重變化與模型組（接種病毒組）的體重增長(zhǎng)相似，在第5天體重明顯增長(zhǎng)；牛初乳高劑量組、牛初乳聯(lián)合利巴韋林組以及陽(yáng)性對(duì)照組（利巴韋林），在第7天體重增長(zhǎng)同正常組。

正常組無(wú)腹瀉發(fā)生，模型組在感染后的3～4d出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、甚至出現(xiàn)脫水現(xiàn)象，牛初乳高劑量組、牛初乳聯(lián)合利巴韋林組以及陽(yáng)性對(duì)照組（利巴韋林）雖出現(xiàn)腹瀉，但后期腹瀉程度逐漸減輕；中劑量組出現(xiàn)腹瀉，且無(wú)明顯改善，腹瀉持續(xù)加重。

正常細(xì)胞為單層梭形細(xì)胞，被病毒感染后的小腸制片中可見(jiàn)，細(xì)胞出現(xiàn)褶皺、細(xì)胞內(nèi)顆粒物顯著增加，有部分細(xì)胞甚至出現(xiàn)溶解現(xiàn)象。

4 討論及結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，牛初乳對(duì)輪狀病毒具有一定的抑制作用，且不同劑量的牛初乳具有不同的抑制效果，中劑量組對(duì)抗輪狀病毒的效果不如高劑量組和牛初乳聯(lián)合利巴韋林組，兩組的臨床試驗(yàn)效果差異比較顯著（P＜0.05）。