李　波，王遠(yuǎn)萍，段浩博，劉可可，唐思嘉，周　樂，孫宏晨

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，吉林 長春 130021)

微流控是一種以微組裝結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)并在顯微尺度處理流體的操作技術(shù)，其具體操作是處理低體積流體以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和高通量篩選，通常在亞毫米的規(guī)模對(duì)流體實(shí)施精確的控制和操縱，流體被移動(dòng)、混合、分離或以其他方式處理。近年來,微流控技術(shù)在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用日漸展現(xiàn)其獨(dú)特貢獻(xiàn)，電穿孔、熱偏差與流體剪切應(yīng)力相繼應(yīng)用于微流控系統(tǒng)設(shè)計(jì)。微流控技術(shù)與傳統(tǒng)膜中斷技術(shù)結(jié)合為新一代細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的建立提供了新思路。本文作者以細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)為例，綜合闡述微流控技術(shù)與傳統(tǒng)膜中斷技術(shù)結(jié)合的具體機(jī)制，歸納研究現(xiàn)狀及尚未解決問題，為微流控體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)提供一個(gè)較為全面和詳細(xì)的框架。

1　微流控技術(shù)

20世紀(jì)60年代初集成電路的發(fā)明實(shí)現(xiàn)了小型化、微電子的影響潮流，集成電路的微加工技術(shù)縮減了流體系統(tǒng)形成第1代系統(tǒng)——?dú)庀嗌V法(gas chromatography，GC)[1]。20世紀(jì)80年代初形成微流體學(xué)，用于噴墨打印頭、DNA芯片、芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)、微推進(jìn)和微熱技術(shù)的開發(fā)。20世紀(jì)90年代，微型機(jī)械系統(tǒng)開始應(yīng)用于微流體學(xué)[2]。源于半導(dǎo)體工業(yè)的微流控技術(shù)，吸納微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)自成一體，經(jīng)常被稱為微型全分析系統(tǒng)(μTAS)或芯片實(shí)驗(yàn)室裝置[3]。微流控是一種以微組裝結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)在顯微尺度處理流體的操作技術(shù)[4]。微流控裝置的核心元素為微孔道、室和閥門，用以完成嚴(yán)格復(fù)雜的操作[4]，其原理包括微量流體層流、低擴(kuò)散率、流體表面效應(yīng)以及電動(dòng)力學(xué)[1]。由于樣品處理快、用量小、流體分析時(shí)控制精確，大幅度減少了樣品和試劑的損耗量，微流控技術(shù)迅速取代了傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)操作[3]，成為備受矚目的新技術(shù)。微流控應(yīng)用于化學(xué)、工程、生物和藥品等眾多領(lǐng)域。微流控在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面[4]：分子水平的核酸、蛋白質(zhì)分析；細(xì)胞水平研究細(xì)胞力學(xué)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分離、細(xì)胞分類還有單個(gè)細(xì)胞分析；材料轉(zhuǎn)運(yùn)；仿生設(shè)計(jì)的材料轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物投遞芯片。

2　體外細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

2.1傳統(tǒng)的膜中斷技術(shù)除了載體介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[5]，基于膜中斷技術(shù)的體外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也備受關(guān)注[6]。膜中斷技術(shù)主要應(yīng)用物理方法例如機(jī)械、電擊、熱力、光學(xué)和化學(xué)因素使細(xì)胞膜形成暫時(shí)的斷裂[6]，使轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)直接穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。以下為幾種傳統(tǒng)的膜中斷方法：化學(xué)方法包括膜活性肽、洗滌劑和穿孔毒素[7]；機(jī)械中斷方法如高速粒子穿透作用、流體剪切應(yīng)力作用[8]和靜水壓/滲透壓的壓力作用[9]；顯微注射法[10]；熱偏差法[6]；電穿孔等。傳統(tǒng)的膜中斷技術(shù)有3個(gè)明顯不足[6]：①傳統(tǒng)的膜中斷技術(shù)會(huì)造成細(xì)胞膜不同程度的損傷，損傷程度小阻礙納米顆粒的有效投遞，損傷程度大導(dǎo)致細(xì)胞損傷；②吞吐量和可伸縮性(如顯微注射)差；③細(xì)胞恢復(fù)不充分，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。例如熱擊和電擊將導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活和細(xì)胞損傷。而近年來，通過微流控操作劑微流控平板或微流控芯片實(shí)現(xiàn)的膜中斷技術(shù)有效地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)膜中斷技術(shù)的不足。細(xì)胞的材料轉(zhuǎn)運(yùn)尤其強(qiáng)調(diào)基于膜中斷技術(shù)的投遞方法以及納米技術(shù)、微流控和實(shí)驗(yàn)室芯片技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.2新一代體外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)新一代轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的建立對(duì)基于細(xì)胞治療和基因編輯的再生醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)生物學(xué)十分必要[6]，臨床試驗(yàn)中基于體外細(xì)胞治療的有效案例主要包括造血干細(xì)胞[11]和T細(xì)胞的免疫治療[12]?；蚓庉嬁蓱?yīng)用于抗腫瘤免疫治療[13]。向多種細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)多種不同材料是新一代轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)面臨的主要挑戰(zhàn)[6]。相對(duì)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，新一代轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要有4個(gè)特點(diǎn)：①改進(jìn)了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，細(xì)胞損傷小；②極大地提高了轉(zhuǎn)運(yùn)效率和吞吐量；③為細(xì)胞靶向物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)提供了新思路；④安全性高，體外物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)臨床應(yīng)用具有借鑒意義。

3　微流控在基于膜中斷技術(shù)的體外轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的應(yīng)用

3.1 微流控與電穿孔結(jié)合與傳統(tǒng)的整體電穿孔不同，通過微流控裝置實(shí)現(xiàn)的電穿孔技術(shù)根據(jù)細(xì)胞的規(guī)模定位電擊領(lǐng)域，進(jìn)而降低電壓(傳統(tǒng)方法所需為100 V)、提高熱量耗散速率[14]，降低對(duì)細(xì)胞的損傷并且極大地提高了轉(zhuǎn)運(yùn)效率[15]。恒定直流電壓可以造成水流中細(xì)胞電穿孔，Geng等[16]進(jìn)行如下設(shè)計(jì)使恒定電壓的強(qiáng)度和頻率根據(jù)細(xì)胞流動(dòng)時(shí)收縮程度變化，主通道設(shè)置一部分收縮部，脈沖強(qiáng)度由主通道和收縮部之間的橫截面比決定，而頻率有細(xì)胞流過的速度決定。根據(jù)不同類型細(xì)胞的直徑確定收縮部的管道直徑和水流速度，選擇適合的電壓強(qiáng)度和頻率。Garcia等[17]設(shè)計(jì)了一個(gè)微流控系統(tǒng)提高了細(xì)菌細(xì)胞電轉(zhuǎn)運(yùn)的效率和吞吐量，微流控裝置非均一收縮的微管道使相對(duì)較小的電壓形成了一個(gè)高電流區(qū)域。流體動(dòng)力學(xué)的介入，比之傳統(tǒng)電穿孔方法，轉(zhuǎn)運(yùn)效率提高了4倍，吞吐量提高了100～1 000倍。對(duì)比于傳統(tǒng)的操作技術(shù)，微流控技術(shù)的應(yīng)用為新一代細(xì)胞投遞系統(tǒng)提供了新思路。

3.2微流控與熱偏差法結(jié)合傳統(tǒng)的熱偏差法雖然能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的材料投遞，但會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞功能。微流控裝置為局域或部分實(shí)行熱中斷技術(shù)提供了可能。實(shí)際上，熱噴墨打印機(jī)處理的細(xì)胞溶液證明了基因轉(zhuǎn)染的成功，但不清楚細(xì)胞的膜中斷實(shí)現(xiàn)是源自噴嘴處的流體剪切效應(yīng)，還是溫度尖峰或兩者均有[18]。由高聚焦超聲熱觸發(fā)的藥物釋放已經(jīng)成為一種重要的藥物投遞方法，這種方法根據(jù)脂質(zhì)對(duì)溫度敏感的特點(diǎn)，能夠?qū)⒛芰烤劢褂谝欢▍^(qū)域從而減少對(duì)細(xì)胞的損傷。當(dāng)攜帶藥物的脂質(zhì)體隨血液循環(huán)到達(dá)患處，高聚焦超聲熱觸發(fā)使患處細(xì)胞通透性增加，實(shí)現(xiàn)靶向給藥[19]。Meng等[19]建立了一個(gè)微流控模型探討其機(jī)制，微流控裝置由40對(duì)環(huán)形電極組成，鑲嵌在1 mm厚、128°Y旋轉(zhuǎn)和X傳播的LiNbO3基板上，并由單相位單向換能器操控。微流控裝置中央放置一個(gè)材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微型細(xì)胞培養(yǎng)皿保證溫度不變，小鼠乳腺癌細(xì)胞通過聚-L-賴氨酸黏附在PDMS表面，加入封裝多柔吡星的脂質(zhì)體。該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞溫度、應(yīng)力變化并闡明其作用機(jī)制，結(jié)果顯示：低熔點(diǎn)的脂質(zhì)在熱能作用下通透性發(fā)生變化，聲波輻射力使細(xì)胞膜損傷。雖然已有以上研究，但熱偏差法的作用機(jī)制仍未完全解決。

3.3 微流控與納米芽膜結(jié)合納米芽管作為生物分子向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的通道確保持續(xù)的物質(zhì)釋放[20]，Xu等[21]利用納米芽管轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將功能性探針轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜內(nèi)，Xu等[22]將納米芽膜與微流控結(jié)合建立了一個(gè)有趣的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。在納米芽膜表面形成密度為3 × 107cm-2、直徑為100 nm的顯微孔道，猶如在納米膜表面建立極密的顯微注射針。將納米芽膜襯于微流控平板培養(yǎng)室底，培養(yǎng)室通過納米芽膜與其下100 μm深、0.5 mm寬的流體通道相同，當(dāng)溶有轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的流體快速流經(jīng)顯微孔道時(shí)，便可通過納米芽膜的針刺作用完成細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。

3.4微流控與機(jī)械力結(jié)合機(jī)械擾動(dòng)的膜中斷技術(shù)主要包括黏附細(xì)胞的刮擦和珠粒負(fù)載[23]或由小規(guī)格針頭重復(fù)抽吸排出的懸浮液中的細(xì)胞[24]?，F(xiàn)代微流控技術(shù)可以增加機(jī)械力的精確度，例如細(xì)胞擠壓的原理是細(xì)胞在通過細(xì)胞直徑的約一半至三分之一的微流體收縮時(shí)快速變形，蛋白質(zhì)、核酸、量子點(diǎn)、碳納米管和其他納米材料已被證明可以通過這種方式遞送[25]。Saung等[26]設(shè)計(jì)了一個(gè)微流控裝置，在微流控平板的孔道上設(shè)置一個(gè)收縮部，根據(jù)不同類型的細(xì)胞直徑確定收縮部的孔道直徑和孔道長度，細(xì)胞通過收縮部時(shí)出現(xiàn)暫時(shí)的破壞，載體即可進(jìn)入細(xì)胞。

椎板黏度計(jì)表面由固體變成液體時(shí)可以產(chǎn)生一個(gè)確定的剪切應(yīng)力，能夠使單層細(xì)胞頂層細(xì)胞膜瞬時(shí)透化[27]。根據(jù)這一現(xiàn)象設(shè)計(jì)了微流控裝置，微流控的微孔道為由直徑300 μm漸變?yōu)?0 μm的錐形孔道，可以根據(jù)細(xì)胞流速產(chǎn)生相應(yīng)的剪切應(yīng)力[28]。但是剪切應(yīng)力不易重復(fù)控制，需輔以微米尺寸的空化氣泡[29]，19世紀(jì)80年代引入了一種新的滲透化方法[30]，即聲波作用可以在溶液中產(chǎn)生空化氣泡[31]。然而，最近多個(gè)公開的數(shù)據(jù)集分析表明超聲主要對(duì)遞送具有大于50%效率或50%活性的體外分子具有較好的成果[31]。這歸因于隨機(jī)和劇烈空化的操作機(jī)制是異質(zhì)的，一些細(xì)胞經(jīng)歷過度損傷，而其他細(xì)胞則不受影響[32-33]。空化氣泡的精確定位為靶向空化提供了良好開端。

4　結(jié)　語

目前，世界各地研究機(jī)構(gòu)和臨床中心使用的細(xì)胞內(nèi)材料遞送方法主要為基于病毒載體、脂質(zhì)體載體和電穿孔等實(shí)驗(yàn)方法，這些已建立的方法具有機(jī)制復(fù)雜、安全性小及其對(duì)細(xì)胞行為不可預(yù)測(cè)的影響等缺點(diǎn)，明顯地限制了生物實(shí)驗(yàn)的范圍并降低了潛在有希望的細(xì)胞治療概念的功效。因此，安全有效的細(xì)胞投遞系統(tǒng)的建立對(duì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)十分重要，并且對(duì)細(xì)胞治療和基因治療等臨床應(yīng)用具有推動(dòng)作用[6]。近年來，微流控技術(shù)在細(xì)胞水平和分子水平的應(yīng)用具有巨大進(jìn)展。微流控為細(xì)胞內(nèi)的材料以及生物大分子的遞送提供了良好平臺(tái)，尤其是與基于膜中斷技術(shù)的傳統(tǒng)遞送方法結(jié)合，建立了系統(tǒng)的微流控模型。而且微流控技術(shù)為細(xì)胞的靶向遞送提供了新思路，對(duì)于不同類型的細(xì)胞已有相應(yīng)類型的遞送材料或生物分子，微流控裝置和微流控技術(shù)未來極有可能實(shí)現(xiàn)向不同系別的細(xì)胞投遞不同分子的商業(yè)化產(chǎn)品。微流控是建立新一代投遞技術(shù)的重要方法，微流控技術(shù)與醫(yī)學(xué)研究的結(jié)合及微流控裝置在醫(yī)學(xué)的應(yīng)用值得不斷地探索研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Novotny J, Foret F. Fluid manipulation on the micro-scale: Basics of fluid behavior in microfluidics [J]. J Sep Sci, 2017, 40(1):383-394.

[2] Nge PN, Rogers CI, Woolley AT. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications [J]. Chem Rev, 2013, 113(4):2550-2583.

[3] Sackmann EK, Fulton AL, Beebe DJ. The present and future role of microfluidics in biomedical research [J]. Nature, 2014, 507(7491):181-189.

[4] Liu Z, Han X, Qin L. Recent progress of microfluidics in translational applications [J]. Adv Healthc Mater, 2016, 5(8):871-888.

[5] Yin H, Kanasty RL, Eltoukhy AA, et al. Non-viral vectors for gene-based therapy [J]. Nat Rev Genet, 2014, 15(8):541-555.

[6] Stewart MP, Sharei A, Ding X, et al.Invitroandexvivostrategies for intracellular delivery [J]. Nature, 2016, 538(7624):183-192.

[7] Gurtovenko AA, Anwar J, Vattulainen I. Defect-mediated trafficking across cell membranes: insights from in silico modeling [J]. Chem Rev, 2010, 110(10):6077-6103.

[8] Xu Z, Lu C, Riordon J, et al. Microfluidic manufacturing of polymeric nanoparticles: comparing flow control of multiscale structure in single-phase staggered herringbone and two-phase reactors [J]. Langmuir, 2016, 32(48):12781-12789.

[9] Borle AB, Snowdowne KW. Measurement of intracellular free calcium in monkey kidney cells with aequorin [J]. Science, 1982, 217(4556):252-254.

[10]Grady ME, Parrish E, Caporizzo MA, et al. Intracellular nanoparticle dynamics affected by cytoskeletal integrity [J]. Soft Matter, 2017, 13(9):1873-1880.

[11]Naldini L.Exvivogene transfer and correction for cell-based therapies [J]. Nat Rev Genet, 2011, 12(5):301-315.

[12]June CH, Riddell SR, Schumacher TN. Adoptive cellular therapy: a race to the finish line [J]. Sci Translat Med, 2015, 7(280):280-287.

[13]Naldini L. Gene therapy returns to centre stage [J]. Nature, 2015, 526(7573):351-360.

[14]Movahed S, Li D. Microfluidics cell electroporation [J]. Microfluidics Nanofluidics, 2011, 10(4):703-734.

[15]Garcia PA, Ge Z, Moran JL, et al. Microfluidic screening of electric fields for electroporation [J]. Sci Rep, 2016, 6:21238.

[16]Geng T, Zhan Y, Wang HY, et al. Flow-through electroporation based on constant voltage for large-volume transfection of cells [J]. J Controlled Release, 2010, 144(1):91-100.

[17]Garcia PA, Ge Z, Kelley LE, et al. High efficiency hydrodynamic bacterial electrotransformation [J]. Lab Chip, 2017, 17(3):490-500.

[18]Cui X, Dean D, Ruggeri ZM, et al. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells [J]. Biotechnol Bioeng, 2010, 106(6):963-969.

[19]Meng L, Deng Z, Niu L, et al. A disposable microfluidic device for controlled drug release from thermal-sensitive liposomes by high intensity focused ultrasound [J]. Theranostics, 2015, 5(11):1203-1213.

[20]Fox CB, Cao Y, Nemeth CL, et al. Fabrication of sealed nanostraw microdevices for oral drug delivery [J]. Acs Nano, 2016, 10(6):5873-5881.

[21]Xu AM, Wang DS, Shieh P, et al. Direct intracellular delivery of cell-impermeable probes of protein glycosylation by using nanostraws [J]. Chembiochem, 2017, 18(7):623-628.

[22]Xu AM, Kim SA, Wang DS, et al. Temporally resolved direct delivery of second messengers into cells using nanostraws [J]. Lab Chip, 2016, 16(13):2434-2439.

[23]Mcneil PL. Incorporation of macromolecules into living cells [J]. Methods Cell Biol, 1989, 29:153-173.

[24]Clarke MS, Mcneil PL. Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol [J]. J Cell Sci, 1992, 102 (Pt 3):533-541.

[25]Sharei A, Zoldan J, Adamo A, et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery [J]. Proceed Nat Acad Sci USA, 2013, 110(6):2082-2087.

[26]Saung MT, Sharei A, Adalsteinsson VA, et al. A size-selective intracellular delivery platform [J]. Small, 2016, 12(42):5873-5881.

[27]LaPlaca MC, Lee VM, Thibault LE. An in vitro model of traumatic neuronal injury: loading rate-dependent changes in acute cytosolic calcium and lactate dehydrogenase release [J]. J Neurotrauma, 1997, 14(6):355-368.

[28]Hallow DM, Seeger RA, Kamaev PP, et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics [J]. Biotechnol Bioeng, 2008, 99(4):846-854.

[29]Marmottant P, Hilgenfeldt S. Controlled vesicle deformation and lysis by single oscillating bubbles [J]. Nature, 2003, 423(6936):153-156.

[30]Fechheimer M, Boylan JF, Parker S, et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading [J]. Proc Nat Acad Sci USA, 1987, 84(23):8463-8467.

[31]Liu Y, Yan J, Prausnitz MR. Can ultrasound enable efficient intracellular uptake of molecules? A retrospective literature review and analysis [J]. Ultrasound Med Biol, 2012, 38(5):876-888.

[32]Ohl CD, Arora M, Ikink R, et al. Sonoporation from jetting cavitation bubbles [J]. Biophys J, 2006, 91(11):4285-4295.

[33]Wu G, Mikhailovsky A, Khant HA, et al. Remotely triggered liposome release by near-infrared light absorption via hollow gold nanoshells [J]. J Am Chem Soc, 2008, 130(26):8175-8177.