(株洲市中心醫(yī)院，湖南 株洲 412007 1 血液科實(shí)驗(yàn)室； 2 血液科)

腎母細(xì)胞瘤基因1(WT1)基因最早于1990年由CALL從兒童腎母細(xì)胞瘤中分離并鑒定出來[1]，定位于人染色體11p13。研究證實(shí)其編碼的鋅指蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活和抑制雙重功能，在調(diào)控細(xì)胞的生長和分化中發(fā)揮著重要作用[2]。本研究通過對我院初治急性白血病(AL)病人治療各階段骨髓中WT1 mRNA表達(dá)水平檢測，進(jìn)一步探討其表達(dá)水平與病人病程及預(yù)后關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月—2016年12月于我院就診的初診為AL病人65例，其中男40例，女25例；平均年齡(51.3±18.5)歲。所有病人均經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)、流式免疫分型、染色體以及融合基因檢測確診，按照FAB標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分型：急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)8例，急性髓系白血病(AML)54例(其中M2 22例，M3 14例，M5 18例)，急性混合細(xì)胞性白血病(AMLL)1例，骨髓增生異常綜合征急變M2 1例，慢性粒細(xì)胞白血病急變M2 1例。同期選擇健康志愿者10例和再生障礙性貧血10例作為對照組。初診AL病人及治療各階段所取標(biāo)本均為骨髓標(biāo)本，對照組中健康志愿者為外周血標(biāo)本，再生障礙性貧血為骨髓標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑

紅細(xì)胞裂解液(天根生化科技有限公司)，WT1 mRNA檢測試劑盒(上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司)，ABI7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 研究方法

1.3.1細(xì)胞總RNA的提取 取EDTA抗凝的病人骨髓或外周血適量，加入2倍體積的紅細(xì)胞裂解液與之混勻，置4 ℃冰箱10 min(紅細(xì)胞破裂，呈紅色透明狀)，后以5 000 r/min離心2～4 min，棄上清液保留沉淀(可再清洗1次)，在沉淀中加入適量DEPC-H2O，制成細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液，加入3倍體積Trizol，徹底混勻，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，4 ℃保存RQ-PCR待用。

1.3.2WT1 mRNA表達(dá)的檢測 采用RQ-PCR一步法檢測病人骨髓或外周血中WT1 mRNA的表達(dá)，以ABL為內(nèi)參基因。目的基因(或內(nèi)參基因)反應(yīng)體系：目的基因(或內(nèi)參基因)反應(yīng)液8 μL+酶液2 μL+RNA 15 μL，總體積為25 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 30 min；94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共進(jìn)行40個循環(huán)。獲得擴(kuò)增曲線，得到WT1基因及ABL基因檢測濃度。WT1 mRNA相對表達(dá)量=(WT1基因檢測濃度/ABL基因檢測濃度)×100%。以骨髓中WT1 mRNA的相對表達(dá)量>0.55%為陽性，外周血中WT1 mRNA相對表達(dá)量>0為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 對照組及AL組WT1 mRNA的表達(dá)

65例AL病人51例骨髓中WT1 mRNA表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為78.5%；其中8例ALL病人中5例表達(dá)陽性,陽性表達(dá)率為62.5%；56例AML病人中45例表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為80.4%，該基因在ALL及AML骨髓中表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。1例AMLL病人骨髓中WT1 mRNA相對表達(dá)量為272.3%。對照組骨髓和外周血中均未檢測到WT1 mRNA的表達(dá)。AML中M2、M3、M5亞型病人骨髓中WT1 mRNA相對表達(dá)量中位數(shù)分別為50.65%、162.2%、39.29%，初診AL病人各亞型間(排除AMLL)骨髓中WT1 mRNA相對表達(dá)量差異有顯著性(χ2=433.878,P<0.01)；M2、M5亞型病人WT1 mRNA的相對表達(dá)量均明顯低于M3亞型病人(Z=-15.266、-19.147,P<0.01)；M2亞型病人WT1 mRNA相對表達(dá)量明顯高于M5亞型病人(Z=-4.518,P<0.01)。

2.2 WT1 mRNA表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系

經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方案化療后，隨訪觀察12個月，排除死亡及脫訪者，動態(tài)監(jiān)測53例AL病人WT1 mRNA的表達(dá)，其中40例達(dá)到CR，5例NR，8例復(fù)發(fā)，其中4例WT1 mRNA已轉(zhuǎn)陰的病人在臨床提示CR時WT1 mRNA轉(zhuǎn)為陽性，而此時血常規(guī)及形態(tài)學(xué)均提示CR，比形態(tài)學(xué)確認(rèn)的臨床復(fù)發(fā)提前了平均(68±18.67)d。根據(jù)病人的療效，將其分為初診組、復(fù)發(fā)組、NR組、CR組。初診組、復(fù)發(fā)組、NR組、CR組WT1 mRNA相對表達(dá)量中位數(shù)分別為34.5%、59.4%、79.6%、0。初診組、復(fù)發(fā)組、NR組WT1 mRNA的相對表達(dá)量均顯著高于CR組，差異有顯著性(Z=-6.089～-5.450，P<0.01)；初診組、復(fù)發(fā)組與NR組WT1 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

初診時WT1 mRNA陽性的39例病人中獲得完全緩解26例，復(fù)發(fā)8例，CR率為66.67%，復(fù)發(fā)率為20.5%，WT1 mRNA陰性的14例病人中獲得完全緩解14例，CR率為100%，復(fù)發(fā)率為0，兩者CR率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012)，兩者復(fù)發(fā)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

大量研究表明，WT1基因是抑癌基因，同時又發(fā)揮癌基因樣作用，在血液系統(tǒng)惡性疾病中起非常重要的作用[3-4]。本研究發(fā)現(xiàn)，WT1 mRNA在AL的骨髓中有較高表達(dá)，在正常人的骨髓或外周血中未檢測到其表達(dá)，與文獻(xiàn)報道的在白血病細(xì)胞中高表達(dá)，在正常成熟細(xì)胞中無表達(dá)或者極微量表達(dá)一致[5-6]，說明WT1基因與AL的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能參與了白血病細(xì)胞的分化[7-8]。本研究結(jié)果顯示，ALL、AML病人骨髓中WT1 mRNA表達(dá)陽性率分別為62.5% 和80.4%，兩組陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致[5,9-10]。在AML各亞型中，M3組WT1 mRNA相對表達(dá)水平最高，其次是M2，再次是M5，這也與相關(guān)文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[11-12]。國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果[3,5-6]和本研究結(jié)果均證明 WT1 mRNA 在AL中過表達(dá)，且具有較高的陽性率，提示W(wǎng)T1 mRNA檢測可具有更廣泛的臨床應(yīng)用價值，尤其是對于無特異分子學(xué)標(biāo)記的AL。

本研究跟蹤隨訪53例AL病人，對其不同轉(zhuǎn)歸進(jìn)行分組，比較他們之間的WT1 mRNA表達(dá)水平，初診組、復(fù)發(fā)組、NR組病人的WT1 mRNA表達(dá)水平顯著高于CR組。提示W(wǎng)T1 mRNA的表達(dá)水平可作為評估疾病療效、預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸的有效指標(biāo)之一，特別是對于無特異性基因標(biāo)志的白血病病人。有學(xué)者分析AML病人WT1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示W(wǎng)T1高表達(dá)組治療后1年CR率低于WT1低表達(dá)組，而兩組復(fù)發(fā)率比較差異無顯著性[13-14]，這與本研究結(jié)果基本一致。而陸麗娜等[15]對AML病人預(yù)后研究顯示，WT1增高組比WT1正常組復(fù)發(fā)率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但是與本研究結(jié)果有一定差異，可能與治療方案及疾病結(jié)構(gòu)組成不同有關(guān)。

AL是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，目前隨著治療方法和藥物的更新，緩解率已經(jīng)得到了很大提高，但是白血病易復(fù)發(fā)仍是治療中難以攻克的難題，微小殘留病灶(MRD)是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的直接原因，與病人預(yù)后密切相關(guān)，動態(tài)監(jiān)測MRD能有助于監(jiān)測治療效果以及早期預(yù)測血液學(xué)復(fù)發(fā)情況[16-18]。本研究動態(tài)觀察WT1 mRNA不同疾病階段的表達(dá)，結(jié)果顯示初診WT1 mRNA陽性表達(dá)病人隨著治療的好轉(zhuǎn) WT1 mRNA 表達(dá)水平逐漸下降直至轉(zhuǎn)陰，WT1 mRNA已轉(zhuǎn)陰的病人隨著病情的復(fù)發(fā) WT1 mRNA可轉(zhuǎn)陽，并且可早于臨床指標(biāo)提示的復(fù)發(fā)，WT1 mRNA表達(dá)陽性且未達(dá)到CR的病人WT1 mRNA表達(dá)持續(xù)陽性，WT1 mRNA 陽性表達(dá)組具有更低的緩解率。提示 WT1 mRNA可作為評估治療效果、判斷預(yù)后、預(yù)測復(fù)發(fā)及MRD監(jiān)測的臨床指標(biāo)之一。這與國內(nèi)相關(guān)研究結(jié)果一致[19-20]，與國外學(xué)者認(rèn)為WT1可以作為一種新的泛白血病基因用于MRD的監(jiān)測以及預(yù)測復(fù)發(fā)的結(jié)論也是一致的[18,21]。

綜上所述，應(yīng)用RQ-PCR一步法可以高效快速地檢測AL病人WT1 mRNA表達(dá)水平，具有重要的臨床價值，對AL病人疾病的進(jìn)展、療效的監(jiān)測、判斷預(yù)后、預(yù)測復(fù)發(fā)及MRD的監(jiān)測均有重要意義，尤其是對于無特異性分子學(xué)標(biāo)志物的白血病，為臨床個體化精準(zhǔn)治療提供更可靠的依據(jù)。