孫夢潔 金巨樓 楊軍星 宋立杰 盧亞東 王博蔚 劉志輝

創(chuàng)傷、感染、腫瘤、以及各種先天性疾病是導(dǎo)致骨缺損的主要原因，骨移植作為骨缺損修復(fù)的常用手段，其材料包括自體骨、同種異體骨、異種或人工合成骨移植材料。理想的移植材料必須具有足夠的成骨能力、骨誘導(dǎo)及骨傳導(dǎo)能力。脫鈣骨基質(zhì)（demineralized bone matrix，DBM）作為自體骨移植的替代材料，是去除了無機(jī)成分的骨。因具有良好的骨誘導(dǎo)、骨傳導(dǎo)及促成骨能力，自1965年Urist[1]首次提出DBM具有骨誘導(dǎo)能力以來，其對于骨缺損的修復(fù)一直受到人們的青睞。

一、DBM促成骨機(jī)制

在體外采用一系列化學(xué)方法對同種異體骨行脫鈣、去脂處理后，成為含有Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅹ型膠原蛋白，非膠原蛋白，生長因子，少量磷酸鈣及細(xì)胞碎片的混合物[2]，即DBM。臨床DBM來源可以為松質(zhì)骨或皮質(zhì)骨，正常人干燥骨在脫礦的過程中，表面的抗原結(jié)構(gòu)被去除，抗原性降低。在骨修復(fù)和重建過程中，骨基質(zhì)可提供多種蛋白質(zhì)及生長因子，包括骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）[3]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是多功能細(xì)胞因子，屬于TGF-β超家族。在已發(fā)現(xiàn)的BMPs中，BMP2、4、7具有成骨潛力。由于BMPs的存在，使得DBM具有促成骨能力。在骨形成的過程中，BMPs與細(xì)胞膜表面的Ⅰ、Ⅱ型受體結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)Smad1、5、8蛋白磷酸化，磷酸化的蛋白從受體釋放后，與Smad4蛋白結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核。在成骨細(xì)胞中，該復(fù)合物與其他轉(zhuǎn)錄因子如Runx2結(jié)合，參與目的基因的轉(zhuǎn)錄[4]。Runx2與激活的Smads蛋白兩者之間的協(xié)調(diào)活動為骨架形成的關(guān)鍵。除Smads蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之外，BMPs還可通過絲裂原活化蛋白激酶如p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，作用于Runx2基因，控制間充質(zhì)前體細(xì)胞的分化[5]。除BMPs外，DBM中還含有少量的IGF、FGF、VEGF、PDGF，這些生長因子除促進(jìn)血管的形成外，還有利于間充質(zhì)細(xì)胞的增殖和成骨細(xì)胞的招募[6]。

二、基于骨誘導(dǎo)性DBM在骨缺損修復(fù)中的單獨(dú)應(yīng)用

使用自體骨和異體移植物修復(fù)骨缺損時，成功的骨誘導(dǎo)依賴于未分化的干細(xì)胞具有高的分化、成骨能力，以取代受傷的終末分化細(xì)胞。DBM因含有BMPs，可刺激植骨區(qū)周圍間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)新骨形成，具有骨誘導(dǎo)性，可單獨(dú)應(yīng)用DBM修復(fù)骨缺損。

骨缺損區(qū)應(yīng)用DBM可促進(jìn)骨修復(fù)，Lee等[7]在雙側(cè)下頜升支矢狀劈開截骨后，對植入DBM與未植入對照組應(yīng)用CBCT分析骨增量，發(fā)現(xiàn)前期兩組骨體積均增大，但術(shù)后第6個月DBM組體積增加依舊明顯，對照組體積幾乎不變，表明DBM可促進(jìn)骨的形成。

因DBM具有一定的孔隙率，與周圍組織的生物相容性及自身的可降解性，使得DBM也可作為促成骨因子及相關(guān)藥物的載體[3]。Huber等[8]以DBM作為BMP-2的載體，在體外實(shí)驗(yàn)中BMP-2有效成骨濃度可保持56天，在動物骨缺損模型中，與自體骨移植及空白對照組相比，負(fù)載BMP-2的實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出強(qiáng)大的誘導(dǎo)成骨特性。對于感染造成的骨不連，Lewis等[9]的研究表明，DBM作為抗生素的載體，在體外試驗(yàn)中，負(fù)載慶大霉素的DBM，可至少保持13天臨床藥物釋放水平，加載的抗生素不影響DBM的骨誘導(dǎo)性。

三、基于骨誘導(dǎo)性DBM在骨缺損修復(fù)中的聯(lián)合應(yīng)用

DBM制備過程中，骨的無機(jī)成分喪失，生長因子的活性也受到一定影響，使其力學(xué)性能及促成骨能力下降。為提高修復(fù)效果，DBM常與其它植骨材料聯(lián)合使用。在臨床使用過程中，DBM可以聯(lián)合自體骨/骨髓、無機(jī)材料、有機(jī)材料、富血小板血漿、富血小板纖維蛋白等，以實(shí)現(xiàn)缺損區(qū)骨的重建。

1.DBM聯(lián)合自體骨/骨髓修復(fù)骨缺損：DBM作為天然聚合物具有生物相容性，常與自體骨聯(lián)合應(yīng)用修復(fù)骨缺損，可減少自體骨移植量，盡可能的減少供區(qū)并發(fā)癥。骨髓中存在豐富的干細(xì)胞及生長因子，與DBM聯(lián)合應(yīng)用可以促進(jìn)植骨區(qū)的骨重建。在治療脛骨缺損行牽張成骨術(shù)時，術(shù)區(qū)聯(lián)合植入DBM與自體骨髓，可提高對接位點(diǎn)的融合率，縮短治療時間[10]。

2.DBM聯(lián)合無機(jī)材料修復(fù)骨缺損：DBM為酸提取的有機(jī)基質(zhì)，其主要成分為膠原蛋白。由于生物體內(nèi)蛋白酶的存在，膠原蛋白在生理環(huán)境中易降解，與自體骨相比，DBM結(jié)構(gòu)相對不穩(wěn)定。將天然無機(jī)材料（如羥基磷灰石）或人工合成無機(jī)材料與DBM聯(lián)合，可提高移植物的力學(xué)強(qiáng)度。在長骨粉碎性骨折行堅(jiān)強(qiáng)內(nèi)固定術(shù)后，Ayoub等[11]對DBM、β-磷酸三鈣混合移植修復(fù)骨缺損的結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)混合移植可很好的替代自體骨移植。

3.DBM聯(lián)合有機(jī)材料修復(fù)骨缺損：在制備DBM過程中，骨脫脂后可能引起自身骨誘導(dǎo)性下降。卵磷脂是骨鈣化前脂質(zhì)的主要成分，Han等[12]將DBM與卵磷脂混合材料放入前腹壁肌肉或皮下，28天后可觀察到骨的形成。在DBM中加入卵磷脂可增加材料的骨誘導(dǎo)性，當(dāng)DBM中卵磷脂含量為60%時，復(fù)合材料的骨誘導(dǎo)顯著增強(qiáng)。聚乳酸為多孔的有機(jī)材料，在修復(fù)兔橈骨節(jié)段性骨缺損時，聯(lián)合應(yīng)用DBM與聚乳酸后，骨重建效果與自體骨移植相似[13]。

4.DBM聯(lián)合富血小板血漿修復(fù)骨缺損：富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是將全血離心后，得到的富含高濃度血小板的血漿，體外加入凝血酶后呈膠狀。許多生長因子包括PDGF、VEGF、TGFβ1-2及FGF在血小板顆粒中沉積，刺激存在時這些生長因子的釋放有利于血管的形成，從而促進(jìn)骨的重建，有研究表明應(yīng)用PRP可輔助長骨缺損的愈合[14]。在體外試驗(yàn)中，將來自犬臍帶基質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞與PRP、DBM共培養(yǎng)，21天后OPN及骨鈣素基因表達(dá)明顯增多，間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出成骨潛力[15]。然而一些學(xué)者在動物實(shí)驗(yàn)或臨床應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)DBM與PRP聯(lián)合應(yīng)用修復(fù)骨缺損時，兩者的協(xié)同效果不明顯[16～18]。原因可能與凝血酶的活性及PRP的濃度有關(guān)[17，18]。Han 等[19]就 PRP 中凝血酶活性對DBM骨誘導(dǎo)性的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在體外試驗(yàn)中，加入凝血酶可以激活血小板使其釋放大量生長因子；在體內(nèi)凝血酶的活性對整個成骨過程起抑制作用，只有無凝血酶活性時，PRP可顯著增加DBM的骨誘導(dǎo)性。目前對于PRP的體內(nèi)應(yīng)用，是否需要加入凝血酶激活血小板尚存在爭議，此外聯(lián)合應(yīng)用時PRP最佳濃度的確定仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

5.DBM聯(lián)合富血小板纖維蛋白修復(fù)骨缺損：富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是全血離心后繼PRP得到的第二代血小板濃縮物，其內(nèi)含有 PDGF、VEGF、TGF-β1、IGF-1 等生長因子，通常被用作自體骨或異體骨移植的輔助物。在骨愈合過程中，血小板中生長因子的釋放對細(xì)胞的增殖、基質(zhì)的產(chǎn)生、骨的形成和膠原蛋白的合成起至關(guān)重要的作用。PRF中致密的纖維蛋白基質(zhì)，使得白細(xì)胞和血小板中的生長因子緩慢釋放，有利于骨重建。Chandradas等[20]對PRF與DBM聯(lián)合應(yīng)用與否對牙槽骨內(nèi)缺損的修復(fù)效果進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)PRF有利于牙周病導(dǎo)致的牙槽骨缺損的愈合，與DBM聯(lián)合應(yīng)用效果增加。在臨床實(shí)驗(yàn)中，將60例牙周病引起的牙槽骨內(nèi)缺損患者分為兩組，分別應(yīng)用DBM及DBM+PRF修復(fù)骨缺損，12個月后從牙周袋深度、臨床附著水平、牙齦退縮及X線影像結(jié)果進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)兩種治療方式均引起臨床和放射學(xué)參數(shù)的改變，DBM+PRF組效果更加顯著[21]。然而，在實(shí)行上頜竇提升術(shù)的動物模型中，PRF與DBM或異種骨膠原聯(lián)合應(yīng)用并不能明顯促進(jìn)骨的形成[22]。Panda等[23]就自體血小板濃縮物對骨內(nèi)缺損修復(fù)的結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)性回顧及Meat分析，結(jié)果表明目前仍缺乏足夠的證據(jù)證明PRF與移植材料的聯(lián)合應(yīng)用的效果。DBM與PRF對骨的重建是否存協(xié)同效應(yīng)仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

四、基于骨傳導(dǎo)性DBM作為骨組織工程支架修復(fù)骨缺損

在生長發(fā)育過程中，骨的再生需要細(xì)胞和生長因子在時間、濃度和特定組織部位的協(xié)調(diào)配合作用。DBM作為多孔的、可生物降解的骨替代材料，具有骨傳導(dǎo)性。在修復(fù)骨缺損時，骨組織可沿DBM表面或其內(nèi)部孔隙延伸，DBM支架還為新生毛細(xì)血管的長入提供平臺。隨著礦物質(zhì)在缺損部位的沉積、新骨形成，DBM在體內(nèi)逐漸降解。因DBM的三維空間結(jié)構(gòu)和力學(xué)傳導(dǎo)性能，近年來對DBM的研究主要集中在將其作為骨組織工程的支架，復(fù)合成骨相關(guān)細(xì)胞或生長因子替代自體骨移植。通過DBM支架負(fù)載多種細(xì)胞和生長因子，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和生長因子在時間和空間上的整合，可最大限度的提高骨缺損的修復(fù)能力。

鑒于DBM臨床長期使用歷史、商業(yè)來源的多樣性及與傳遞的細(xì)胞和周圍組織的生物相容性，通過加載技術(shù)及降解動力學(xué)控制生長因子的釋放，DBM作為骨組織工程的支架材料具有很大的優(yōu)勢。Liang等[24]采用CBCT對牙槽突裂患者骨移植修復(fù)術(shù)后的骨增量及骨密度進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)rh-BMP2/DBM支架聯(lián)合移植修復(fù)效果與自體髂骨移植無明顯差異。Hammoudeh等[25]對501例牙槽突裂修復(fù)術(shù)進(jìn)行回顧性分析，rh-BMP2/DBM可很好的替代自體髂骨移植。

在臨床應(yīng)用中，骨組織工程移植仍存在一些問題。研究表明，細(xì)胞接種密度及氧的供應(yīng)可影響組織工程骨移植的質(zhì)量[26]。不同的培養(yǎng)環(huán)境，如細(xì)胞密度的不同，可對種子細(xì)胞的生長動力學(xué)及基因的表達(dá)模式產(chǎn)生影響。植入?yún)^(qū)周圍血管中的氧和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸距離較短，只能為DBM支架表面的細(xì)胞提供營養(yǎng)，常導(dǎo)致骨移植失敗。此外，對于廣泛的骨缺損，若組織工程骨的血管化不能有效形成，種子細(xì)胞由于缺氧、凋亡以及位于移植物中心的壞死，常導(dǎo)致修復(fù)失敗。

五、DBM支架的改性

DBM具有良好的生物相容性及生物降解特性，但作為骨組織工程支架，仍具有一些不足，如負(fù)載種子細(xì)胞及生長因子的數(shù)量及能力有限，只能在一定程度上實(shí)現(xiàn)骨重建；脫鈣后DBM的機(jī)械強(qiáng)度降低，不能承擔(dān)植入位點(diǎn)的機(jī)械應(yīng)力等。通過對支架的改性可彌補(bǔ)其存在的不足。

1.DBM支架表面納米改性：通過新工藝制備納米級DBM，其表面形成的不規(guī)則納米溝槽使自身表面積/體積比增加，可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附及基質(zhì)的分泌，利于骨修復(fù)。Leszczak等[27]通過靜電紡絲技術(shù)制作納米DBM，并與人皮膚成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測結(jié)果表明支架對人皮膚成纖維細(xì)胞無毒性反應(yīng)，具有良好的生物相容性。

2.DBM支架表面修飾：通過生長因子與DBM支架表面的結(jié)合，對支架表面修飾后，支架中生長因子的持續(xù)釋放，可增強(qiáng)植入位點(diǎn)的生長因子水平利于缺損區(qū)骨的愈合。在大鼠顱骨缺損模型中，Horváthy等[28]將血清白蛋白涂布于DBM表面，體外觀察到大量干細(xì)胞附著，體內(nèi)植入?yún)^(qū)新骨的密度、機(jī)械強(qiáng)度高于DBM組。膠原結(jié)合基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 -1α （collagen-binding stromal-cell-derived factor-1，CBD-SDF-1α）對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有趨化作用，與此同時還可抑制破骨細(xì)胞的生成，在大鼠股骨缺損模型，CBD-SDF-1α修飾的DBM支架在植入后可招募內(nèi)源性干細(xì)胞在骨缺損部位的聚集，有助于骨缺損部位礦物質(zhì)的累積及骨體積的增加，術(shù)后檢測到骨橋蛋白、骨鈣素表達(dá)顯著增加，同時新生骨強(qiáng)度優(yōu)于DBM組[29]。組織工程骨移植術(shù)后血管再生對骨再生至關(guān)重要，促進(jìn)血管生成的生長因子修飾后的支架利于移植材料的血管化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移以及多種黏附分子的表達(dá)，在體內(nèi)外具有強(qiáng)有力的促血管生成作用。一些學(xué)者[30]在裸鼠皮下成骨模型中，Micro-CT掃描及組織學(xué)分析結(jié)果表明，EV修飾的DBM支架可促進(jìn)血管生成及骨再生。但如何控制植入位點(diǎn)周圍的有效生長因子濃度以及生長因子的有序釋放仍是一個亟待解決的問題。

3.DBM支架仿生學(xué)改性：利用短肽對DBM支架行仿生學(xué)改性，可提高支架對細(xì)胞和生長因子的黏附能力。短肽可均分DBM孔徑，其作為細(xì)胞黏附受體的配體，除促進(jìn)細(xì)胞黏附外，因短肽中氨基酸帶有一定的電荷，可吸引帶異電荷的生長因子。一些學(xué)者[31，32]的研究表明，利用自組裝肽修飾DBM支架后可富集更多的細(xì)胞及生長因子，有利于骨的重建。

4.DBM支架再礦化：DBM的再礦化有利于承受植入位點(diǎn)的機(jī)械應(yīng)力，利于骨重建。DBM作為骨組織工程支架，具有很強(qiáng)的抗拉強(qiáng)度及骨誘導(dǎo)性，其主要不足是礦物成分的缺乏造成的低機(jī)械穩(wěn)定性。近來一些學(xué)者使用含鈣溶液交替浸泡DBM后，孔隙內(nèi)磷酸氫鈣等礦物質(zhì)的沉積使支架的抗壓強(qiáng)度提高，與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)時，細(xì)胞的增殖及分化不受影響，此外成骨基因的表達(dá)顯著增加[33，34]。

DBM除作為骨移植替代物，還可充當(dāng)成骨因子及藥物的載體。骨組織工程為細(xì)胞的黏附、遷移、增殖和分化提供成骨微環(huán)境，基于DBM支架的骨組織工程移植在骨缺損修復(fù)方面具有廣闊的發(fā)展前景。DBM作為骨組織工程支架，種子細(xì)胞的接種密度、生長因子的黏附水平、DBM的機(jī)械性能以及骨組織工程的血管化均影響骨缺損修復(fù)的效果，對DBM支架材料改性后可彌補(bǔ)其存在的不足，為最大程度實(shí)現(xiàn)骨重建，改性方法需不斷的優(yōu)化。