宋春蓮,曾敬元，陶 楊，張 雪，謝相悅，劉永波，吳常月，李 鑫，凌萬旭，何 錦，張桂生，蘭春林，王艷芬，李 鮮，舒相華*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明 650201；2.昆明偉牧得生物科技有限公司，云南昆明 650201；3.云南曲靖市陸良滇陸豬研究所，云南曲靖 655815；4.云南省保山市昌寧縣畜牧局，云南昌寧 678100；5.云南省紅河州蒙自動物疫病預(yù)防控制中心，云南蒙自 661100；6.永德縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南臨滄 677600)

豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type two,PVC2)感染是危害我國養(yǎng)豬業(yè)最重要的傳染病。這4種病原單獨(dú)感染或混合感染均能引起豬的腹瀉、繁殖障礙、呼吸道疾病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見的一類疾病，是導(dǎo)致大批豬群死亡的重要原因之一，由于該病傳播迅速，引起豬群腹瀉、嘔吐、脫水，即使豬群耐過存活，仍可引起豬只生長緩慢，致使飼料報(bào)酬降低，增加養(yǎng)殖成本[1]，自2010年秋開始，在東亞及東南亞地區(qū)持續(xù)暴發(fā)流行3年之后，不但毫無平息的趨勢，而且在歐洲部分地區(qū)和美國也開始大面積暴發(fā)流行，我國也從2010年底開始，部分省份的豬場暴發(fā)的豬腹瀉病例明顯增多，尤以仔豬最為嚴(yán)重，主要癥狀表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和高死亡率[2]，目前已成為困擾國際養(yǎng)豬業(yè)的重大問題。豬繁殖障礙性疫病是豬傳染病中危害巨大、極為重要的一類疫病，是由不同病原微生物感染繁殖母豬和種公豬引起的綜合癥候群，主要表現(xiàn)為母豬不孕、流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱仔，公豬睪丸腫大、精液品質(zhì)差等[3]，嚴(yán)重影響種豬的繁殖能力。以上4種病原均為豬呼吸道疾病原發(fā)性病原，它們首先侵入呼吸道和肺臟，破壞呼吸道的防御屏障造成豬體呼吸道的抵抗力下降，繼而引起繼發(fā)感染[3]。為了控制和預(yù)防云南省的豬腹瀉、豬繁殖障礙、豬呼吸道疾病，我們對2012年—2016年云南省部分地區(qū)的豬病毒感染情況進(jìn)行了調(diào)查分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來自云南省滇中(昆明、玉溪)，滇南(紅河、臨滄、文山)，滇西(楚雄、大理、怒江、保山、德宏)，滇東(曲靖、昭通)12個地區(qū)規(guī)模豬場1 632份樣品(其中組織樣668份，血樣964份)。

1.1.2 儀器設(shè)備及試劑 超凈工作臺，恒溫生化培養(yǎng)箱，恒溫震蕩培養(yǎng)箱，臺式高速離心機(jī)，移液槍及槍頭，0.2 mL硅烷化PCR管，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備，PCR儀，高壓滅菌鍋，冰箱，水浴鍋，滅菌塑料離心管。全血基因組DNA提取試劑盒，北京百泰克公司產(chǎn)品；病毒核酸DNA/RNA抽提試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 DNA、RNA的提取 全血基因組DNA的提取，采用離心柱試劑盒提取DNA，獨(dú)特的結(jié)合液CB和蛋白酶K能迅速的裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)的核酸酶，之后基因組DNA被異丙醇沉淀出來，被選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜上，再通過一系列快速的漂洗-離心步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后用洗脫緩沖液將基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫下來，獲得DNA產(chǎn)物。

采集的組織反復(fù)凍融3次，然后4℃條件下12 000 r/min離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，混勻，室溫放置10 min，然后4℃條件下12 000 r/min離心15 min；按病毒核酸DNA/RNA抽提試劑盒的操作說明提取核酸樣品，于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 取上述抽提的核酸樣品12 μL，按操作說明加入相應(yīng)試劑，按各種病毒核酸PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增。 各反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物在10 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察，擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小基本一致的片段則判定為陽性。

2 結(jié)果

2.1 病料中CSFV、PRRSV、PRV、PVC2的PCR檢測結(jié)果

由表1可見，云南省2012年—2016年P(guān)VC2的陽性率最高，為40.25%，其次是PRRSV，陽性率為21.40%，CSFV、PRV的陽性率分別為8.91%和4.11%。

表1 2012年—2016年CSFV、PRRSV、PRV、PVC2的PCR檢測結(jié)果

由表1可見，2012年—2016年，豬圓環(huán)病毒2型感染陽性率最高，分別為43.75%、37.25%、28.38%、53.06%和47.83%；其次為豬繁殖與呼吸綜合征病毒，陽性率分別為13.16%、10.48%、29.93%、16.87%和29.58%；豬偽狂犬病病毒陽性率分別為2.38%、0.00%、2.65%、13.33%和1.37%，豬瘟病毒陽性率16.27%、9.09%、9.09%、4.11%和7.14%。不同年份，豬圓環(huán)病毒2型感染2014年最低，2015年和2016年有上升趨勢；豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染2014年和2016年相對較高，2013年最低；豬瘟病毒感染有逐年下降的趨勢；豬偽狂犬病病毒感染2015年最低，但2015年仍有檢出。

2.2 2012年-2016年病毒混合感染情況

CSFV+PRRSV、CSFV+PRV、CSFV+PVC2、PRRSV+PRV、PRRSV+PVC2二重感染的陽性率分別為1.73%、0.62%、3.44%、1.89%、6.32%和2.31%，CSFV+PRV+PVC2和PRRV+PRV+PVC2三重感染的陽性率分別為0.71%和0.68%，無四重感染(圖1)。

2.3 2012年-2016年部分地區(qū)病原陽性情況

圖2可見，CSFV、PRRSV、PRV、PVC2在滇中的陽性率分別為5.31%、28.33%、4.44%和48.62%，在滇南的陽性率分別為12.12%、20.37%、3.70%和29.03%，在滇西的陽性率分別為6.38%、20.41%、7.69%和47.37%，在滇東的陽性率分別為15.57%、7.58%、0.90%和27.27%。

圖1 2012年-2016年4種病毒5年混合感染陽性率

圖2 2012年-2016年4種病毒在各地區(qū)的陽性情況

3 討論

本次調(diào)查結(jié)果顯示，云南省2012年—2016年豬瘟病毒陽性率呈現(xiàn)先下降后上升，2016年表現(xiàn)為上升。云南省2008年—2011年豬瘟病毒感染陽性率分別為20.83%、40.35%、42.53%和16.35%，近幾年來一直呈下降趨勢，說明近年來人們對豬瘟防控的高度重視，取得了較好的防控效果。本次調(diào)查結(jié)果豬瘟病毒感染平均陽性率為8.91%，與國內(nèi)其他地區(qū)近年來報(bào)道有差異。歐瑩[4]報(bào)道，廣西省2012豬瘟病毒陽性率為5.8%，2013年為3.83%，低于本次陽性率；曲哲會等[5]報(bào)道，2010年—2012年豫南地區(qū)豬瘟病毒陽性率為44.2%；王川慶[6]報(bào)道，2014年—2015年河南省部分地區(qū)豬瘟病毒抗體陽性率為19.08%，均明顯高于本次陽性率。本次調(diào)查結(jié)果豬繁殖與呼吸綜合征抗原陽性率最高為29.39%，最低為10.48%。比報(bào)道的2008年—2011年云南省豬繁殖與呼吸綜合征抗原的陽性率分別為46.30%、87.72%、51.72%、37.78%均低，近幾年該病發(fā)病不嚴(yán)重。王雪等[7]報(bào)道，2011年10月—2013年1月，四川省部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征抗原陽性率為10.45%，云南省豬繁殖與呼吸綜合征抗原陽性率比四川省略高；任奕先等[8]報(bào)道，2013年—2014年廣西桂林市豬繁殖與呼吸綜合征抗原陽性率為22.9%，高于本次陽性率。CSF、PRRS二聯(lián)苗是云南省前幾年政府強(qiáng)制免疫接種疫苗，近年來，兩種疫病的有效控制可能與之有關(guān)，然而控制效果有一定的差異，2012年—2016年豬瘟的陽性率一直降低，取得了良好的控制效果，豬繁殖與呼吸綜合征抗原陽性率2012年—2013年降低，之后有上升趨勢，仍比2012年前的陽性率低，說明該二聯(lián)苗對兩種疫病的預(yù)防均有效，但豬藍(lán)耳病的免疫效果弱于豬瘟。

豬偽狂犬病病毒抗原陽性率最高為13.33%、最低為0，均低于2008年-2012年云南省豬偽狂犬病病毒抗原陽性率25.0%、63.16%、43.10%和15.04%，可見近幾年一直呈降低趨勢。鄒敏等[9]報(bào)道，2012年-2013年我國部分地區(qū)的豬偽狂犬病病毒陽性率為8.69%，云南省相比全國各地區(qū)較低；胡帥等[10]報(bào)道，2013年-2014年廣西省豬偽狂犬病病毒陽性率為0.98%，低于本次調(diào)查。近幾年云南省豬偽狂犬病發(fā)病處于較低水平，可能與使用的基因缺失苗有關(guān)，取得了良好的防控效果。

2012年-2016年中，豬圓環(huán)病毒2型的陽性率2015年最高，為53.06%，2014年最低，為28.38%，與 2008年-2011年相比差異不大。萬青山[11]報(bào)道，四川省2011年10月—2013年3月，豬群中PCV2感染的陽性率高達(dá)49.2%；據(jù)遲蘭[12]報(bào)道，徐州地區(qū)2014年10月—2015年5月PVC2的陽性率為40.9%。說明豬圓環(huán)病毒2型感染一直居高不下，難以防控，能造成豬免疫抑制，是導(dǎo)致混合感染的主要原因。

本次調(diào)查幾種病毒混合感染，二重感染中，PRRSV+PVC2最多，為6.32%；CSFV+PRV最少，為0.62%；三重感染較少，CSFV+PRV+PVC2、PRRV+PRV+PVC2分別為0.71%和0.68%，無四重感染。

云南省規(guī)模豬場主要集中在滇中、滇東和滇南。豬瘟病毒陽性率滇南、滇東明顯高于滇中和滇西，豬繁殖與呼吸綜合征病毒滇東地區(qū)陽性率相對較低，豬偽狂犬病病毒陽性率普遍較低，豬圓環(huán)病毒2型滇中、滇西地區(qū)陽性率較高。提示病原陽性率較高的地區(qū)應(yīng)注意該病的防控。

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