樊 琛，曾慶華，王 雷，郭興峰，孫小凡，鄭煥芹

(聊城大學農學院，山東聊城 252059)

某些大腸埃希菌(Escherichiacoli)的致病菌株可引起人畜共患的細菌性傳染病，病型復雜，這些傳染病中危害最大的是急性敗血型。大腸埃希菌的毒力是由多種毒力因子共同作用的，包括黏附素、1型菌毛、毒素、外膜蛋白、ColV質粒、補體抗性、鐵轉運系統(tǒng)、宿主細胞表面改變因子等[1-4]。在敗血型大腸桿菌病中，菌體必須具備抵抗血清抑菌作用和殺菌作用的能力，并能夠在宿主血液環(huán)境中增殖。iss基因編碼的外膜蛋白可以調節(jié)細菌表面對補體敏感的位點，導致細菌表面排斥補體，使菌體具有抵抗宿主血清中補體溶菌作用的能力[5-7]。動物血液中，游離鐵濃度極低，不利于細菌增殖，因此菌體需要具備獲得鐵的能力才能夠在宿主血液中增殖。ybtA基因及chuA基因被認為與雞致病性大腸埃希菌(APEC)的鐵采集系統(tǒng)有關[8-13]。iss基因由于其序列的高保守性，被認為具有亞單位疫苗的潛力。近年來，多項研究致力于將Iss蛋白研發(fā)為亞單位疫苗[14-16]，但其保護機理不明。Iss蛋白免疫動物是否也能對敗血型大腸埃希菌其他毒力因子(如ybtA基因、chuA基因編碼產物)發(fā)揮抑制作用尚無相關研究數(shù)據(jù)。作為單一毒力因子，Iss蛋白能否起到廣泛的免疫保護作用而應用于商業(yè)生產也缺乏試驗依據(jù)。目前尚無Iss亞單位疫苗在生產實際中應用的報道。因此僅采用Iss蛋白這一單一毒力因子制備亞單位疫苗是否具有實際應用潛力，還需要更多的試驗數(shù)據(jù)來支持。本研究采用Iss融合蛋白免疫14日齡雛雞，分別進行動物試驗和體外血清抗性試驗，并比較免疫后的動物血清對iss基因、ybtA基因及chuA基因轉錄的影響，分析Iss融合蛋白在雞大腸桿菌病免疫預防中的應用潛力及不足之處，以期為Iss蛋白作為亞單位疫苗的研究積累數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雞大腸埃希菌HO2株分離自黑龍江某發(fā)病雞場，經中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定為強毒株，血清型為O2，由東北農業(yè)大學預防獸醫(yī)教研室保存，于170 mL/L甘油中-70 ℃冷凍保存[5]；CVCC1553購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，血清型O78，其iss基因序列與HO2菌株的一致。經實驗室早前雛雞致死試驗、雞胚致死試驗、血清抗性試驗檢測，2株菌雛雞致死率均為100%、雞胚致死率均為70%，確定2株菌為強致病性血清抗性菌株[17]。

1.1.2 試劑 LB肉湯、麥康凱瓊脂，青島高科技園海博生物技術有限公司產品；SDS-PAGE蛋白電泳試劑盒和膠回收試劑盒，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司產品產品；兔抗雞IgY H&L (HRP) ，Abcam公司產品產品；TMB染色液，Beyotime Biotechnology公司產品產品；脫脂奶粉，伊利乳業(yè)有限責任公司產品產品；RNA酶抑制劑及dNTP Mixture，TaKaRa公司產品產品；細胞細菌總RNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產品產品；SYBR○RGreen Realtime PCR Master Mix、反轉錄酶，東洋紡(上海)生物科技有限公司產品；純化的Iss融合蛋白為聊城大學食品安全實驗室前期制備，切膠純化產物。

1.1.3 試驗用動物 1日齡雛雞，購自聊城陽谷養(yǎng)雞場，飼養(yǎng)至14日齡進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 抗血清的制備 純化的Iss融合蛋白0.100 mg與等量弗氏佐劑乳化。14日齡雛雞分2組，分別為對照組和免疫組。每組10只，每隔1周肌肉注射免疫1次，四免后5 d，采血分離血清，于-20℃保存?zhèn)溆谩φ战M僅注射佐劑。血清臨用前56℃、30 min滅活補體[1,2,8]。

1.2.2 動物體內試驗 每株待測菌中，14日齡雛雞分3組，分別為空白組、對照組和試驗組。 先按照1.2.1方法免疫，四免后7 d進行攻毒試驗。攻毒試驗時，將待測細菌于LB液體培養(yǎng)基中37℃搖床過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)物用PBS洗2次，并用PBS懸浮。每只雛雞肌肉注射0.2 mL菌液(約109CFU)，每組10只。空白組不免疫不攻毒，對照組僅注射佐劑并攻毒，試驗組免疫并攻毒。連續(xù)觀察7 d，記錄死亡和發(fā)病情況[15-16]。

1.2.3 抗血清效價檢測 純化的融合蛋白用包被液稀釋至10 μg/mL，每孔100 μL。待檢血清倍比稀釋，二抗1∶5 000稀釋。采用常規(guī)間接ELISA檢測抗體效價[1,5]。

1.2.4 間接ELISA 新鮮培養(yǎng)的菌體以全菌體的方式用包被液稀釋至108個/mL，每孔100 μL?？寡?∶100稀釋，二抗1∶5 000稀釋。反應時間、溫度等條件與常規(guī)間接ELISA相同，TMB顯色[1,5]。

1.2.5 凝集試驗 用生理鹽水按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋抗血清，加入等量1×109個/mL的菌液，觀察是否有凝集現(xiàn)象。

1.2.6 抗Iss血清對菌株血清抗性抑制作用的檢測 按1∶100接待測菌于LB中，并分別按1∶100加入56℃ 30 min滅活的Iss蛋白抗血清及陰性對照血清，于37℃培養(yǎng)至對數(shù)期。取1 mL對數(shù)期菌液于8 000 r/min離心5 min，0.6 mol/L NaCl溶液洗2次。9 g/L生理鹽水重懸混勻，倍比稀釋至106CFU/mL。取0.1 mL菌液加入0.5 mL生理鹽水、0.4 mL新鮮雞血清混合，混合物于37℃溫育。分別于0、2 h取樣涂板，37℃培養(yǎng)18 h后平板計數(shù)，記錄菌落數(shù)[1,3]。按下式計算：

試驗組： Δlg=lg(2 h)-lg(0 h)

對照組： Δlg=lg(2 h)-lg(0 h)

抑制作用：ΔΔlg=Δlg(試驗組)-Δlg(對照組)

同時于0、2 h取樣，采用實時熒光定量PCR檢測相關基因mRNA的表達水平。

1.2.7 實時熒光定量PCR RNA提取及反轉錄按試劑盒說明書和實驗室常規(guī)方法進行；real-time PCR中，擴增相應目的片段的引物序列為：iss基因上游引物5′-GCCGCTCTGGCAATGCTTATTACA-3′，下游引物5′-TCCTTTGGTGTTACTGCTGTCGGT-3′；ybtA基因上游引物5′-CCGATTCGAGAGCATTACCC-3′，下游引物5′-CAACAGCAGTGGGAGTCGAT-3′；chuA上游引物5′-CAGATAACAAAAGGAGCAAGGC-3′，下游引物5′-CTGACGATAATACTCACCGCC-3′；GAPDH基因上游引物5′-CATCGTTTCCAACGCTTCCT-3′，下游引物5′-ACCTTCGATGATGCCGAAGTT-3′。反應條件95℃ 3 min；95℃ 10 s，56℃ 30 s，39個循環(huán)。結果用△Ct表示[13]。

2 結果

2.1 體內攻毒試驗結果

雛雞肌肉注射細菌后，注射CVCC1553及HO2菌株的試驗組和對照組雞只均出現(xiàn)腹瀉癥狀，注射CVCC1553的組在觀察期間無死亡，注射HO2的組在觀察期間試驗組和對照組各死亡1只；空白組未出現(xiàn)腹瀉癥狀及死亡(表1)。剩余雞只采血檢測血液中細菌含量，結果顯示,僅HO2菌株攻毒的對照組和試驗組血樣中檢出大腸埃希菌，且對照組和試驗組的活菌數(shù)相近，均為3 CFU/10 mL～4 CFU/10 mL；CVCC1553菌株攻毒的對照組和試驗組血樣中均未檢出大腸埃希菌。表明Iss融合蛋白免疫14日齡雛雞未產生明顯的保護作用。

2.2 抗血清對菌株血清抗性抑制體外試驗結果

待測菌株分別于抗血清及陰性對照血清中溫育后，再與新鮮雞血清混合。HO2菌株的抗血清組及陰性血清組的菌體與新鮮血清混合0 h的活菌數(shù)相近， 2 h后兩組活菌數(shù)差異明顯，抗血清組活菌數(shù)明顯低于陰性血清組的。而CVCC1553菌株的抗血清組及陰性血清組與新鮮血清混合0、2 h的活菌數(shù)均相近，結果用△△lg表示(表1)。

本試驗中，平板計數(shù)的誤差通?！?.200。采用95%置信區(qū)間分析，上限為0.176，下限為-0.158。HO2菌株的△△lg明顯小于下限(-0.158)，可認為抗血清組及陰性血清組菌體在加入新鮮血清培養(yǎng)2 h后的活菌數(shù)有明顯差異，即抗血清組菌體的血清抗性受到抑制。CVCC1553菌株的△△lg大于下限，小于上限，表明抗血清未對菌體的血清抗性產生抑制。

表1 體外血清抗性抑制試驗及體內攻毒試驗結果

2.3 間接ELISA及凝集試驗結果

經間接ELISA檢測，抗血清的效價為1∶100。采用全菌體包被ELISA檢測時，抗血清及陰性血清的待測樣孔ΔOD 492 nm<0.050，P/N<2.1，皆為陰性。在凝集試驗中，各稀釋濃度均未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。說明融合蛋白免疫雛雞產生了相應的抗體，但抗體效價較低。全菌體包被間接ELISA及凝集試驗皆為陰性，表明抗血清與全菌體直接結合的作用較弱。

2.4 實時熒光定量PCR結果

抗血清組及陰性對照血清組培養(yǎng)至對數(shù)期的菌體，與新鮮血清混合后分別于0、2 h取樣，采用實時熒光定量PCR檢測iss、ybtA及chuA基因的mRNA轉錄水平，看家基因為GAPDH，結果用△Ct表示(表2)。

表2 實時熒光定量PCR檢測結果

△Ct越大則樣本拷貝數(shù)越小。由表2可知，HO2菌株iss、ybtA及chuA基因的△△Ct0 h>0，即0 h時抗血清組△Ct0 h均大于陰性血清組，抗血清組的iss、ybtA及chuA基因mRNA拷貝數(shù)低于陰性血清組。表明HO2菌株與抗血清培養(yǎng)后，抗血清對其iss、ybtA及chuA基因mRNA的轉錄水平均產生抑制。CVCC1553菌株iss、ybtA及chuA基因△△Ct0 h<0或接近0，顯示抗血清對CVCC1553菌株這些基因的轉錄未產生明顯的抑制作用。這與體外血清抗性抑制試驗結果一致。提示Iss抗血清可能通過抑制iss等相關基因的轉錄，降低毒力因子的表達，從而抑制菌株的血清抗性。但其抑制作用在不同菌株中的效果差異較大。

3 討論

血清對大腸埃希菌的抑菌作用和殺菌作用可能受到莢膜抗原、脂多糖和特定外膜蛋白等因素影響。抑制菌株的血清抗性或/和降低菌株在血液中的增殖，可減緩大腸桿菌病的進程，尤其是減少敗血癥的發(fā)生。iss基因編碼的外膜蛋白可以通過調節(jié)細胞表面上對補體復合體敏感的位點，導致細胞表面排斥補體，使菌體具有抗血清補體溶菌能力[5-7]。體外試驗中，僅HO2菌株的血清抗性被抗血清抑制。在添加補體之前，抗血清和陰性血清組的活菌數(shù)無顯著差異；但添加補體后，活菌數(shù)出現(xiàn)明顯差異。說明抗體并沒有直接殺死細菌，也不抑制其增殖。推測，抗血清是通過減少Iss蛋白在菌體表面的表達導致菌體血清抗性下降，進而有利于補體發(fā)揮殺菌作用，因此在加入含補體的新鮮血清后，抗血清組的活菌數(shù)明顯下降。采用間接ELISA及凝集試驗分析菌株與抗血清的結合程度，結果全菌體包被的間接ELISA和凝集反應均為陰性，表明抗體與全菌體的直接結合反應較弱；也說明抗血清直接與菌體結合并導致菌體死亡或增殖抑制的可能性較低。由于Iss蛋白錨定在細胞膜上，而不是游離在細胞質中，即使采用超聲裂解等手段，也不能確定所有Iss蛋白均完全暴露，因此不利于間接ELISA的定量分析，僅適于定性分析。ybtA基因及chuA基因的表達產物被認為與雞致病性大腸埃希菌的鐵采集系統(tǒng)有關，可調節(jié)菌體在血清中的鐵獲得能力，有利于菌體在血清中的增殖[8-12]。實時熒光定量PCR檢測基因的mRNA表達顯示，抗血清對HO2菌株iss、ybtA及chuA基因的mRNA轉錄水平產生抑制，但對CVCC1553菌株此3種基因的mRNA轉錄未產生明顯抑制，此結果與血清抗性抑制試驗結果一致。結合實時熒光定量PCR、ELISA、凝集試驗及血清抗性試驗結果，推測菌體在增殖分裂過程中受到抗血清的影響，抑制了基因的轉錄，使菌體對血清環(huán)境敏感性提高。但Iss抗血清的抑制作用在不同菌株間的差異較大，本試驗中的2株菌iss基因序列相同、血清型不同，Iss抗血清對菌株血清抗性的抑制作用與iss基因序列及血清型的關系還需要采用更多試驗樣本進行探討。

雖然Iss抗血清在體外試驗中表現(xiàn)出對HO2菌株血清抗性的抑制作用，但在體內攻毒試驗中雞只經肌肉注射HO2菌株后，對照組與試驗組雞只死亡率沒有差別，發(fā)病情況基本一致，血樣中細菌活菌數(shù)相近。表明Iss融合蛋白免疫14日齡雛雞未表現(xiàn)免疫保護作用。Lynne A M等[15]采用GST-Iss融合蛋白免疫14日齡雛雞，2周后用O1、O2、O78血清型大腸埃希菌菌株攻毒，結果僅O78型菌株攻毒組出現(xiàn)死亡，其中未免疫組死亡3只、免疫組死亡1只(每組12只)；其他組雞只均無死亡。他們認為無死亡的雞只中，免疫組的病變程度比未免疫組的輕，因此認為Iss蛋白具有免疫保護作用及做亞單位疫苗的潛力。本研究中，菌株HO2(血清型O2)免疫組和未免疫組均死亡1只雞；CVCC1553菌株(血清型O78)攻毒組均未出現(xiàn)死亡，并且免疫組與未免疫組雞只的病變程度無明顯差異。這可能與菌株差異有關；但主要因素應是大腸埃希菌的毒力是受多毒力因子控制的，單一毒力因子制備的亞單位疫苗的免疫效果和保護潛力存疑。與血清抗性有關的基因較多，如iss、traT、K1莢膜、LPS合成基因、ompA等[13]。因此，選用遺傳上較保守的基因(如iss基因)制備亞單位疫苗對大腸桿菌病進行預防雖然是較好的思路，有望克服現(xiàn)有疫苗不能進行有效交叉免疫保護的缺陷，但單一基因的亞單位疫苗對動物的保護作用是有限。這也解釋了為什么有關亞單位疫苗的相關論文較多，但卻幾乎沒有后續(xù)實際生產應用的報道[14]。探討多基因聯(lián)合的亞單位疫苗可能具有更好的實際意義。

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