李順琴，楊君敬，何 誠*，王賀民

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；2.中牧研究院疫苗工藝研究所，北京 100194)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性動物疫病，該病傳播迅速，能形成大范圍的流行，嚴重影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展，危害人類健康，并且造成巨大的經(jīng)濟損失[1]?？刂瓶谔阋叩陌l(fā)生與流行非常重要，其最有效的方法之一便是生產(chǎn)出高效能、穩(wěn)定性強、安全性好的疫苗?？谔阋卟《居蠥型、O型、C型、南非Ⅰ型(SATⅠ型)、南非Ⅱ型(SATⅡ型)、南非Ⅲ型(SATⅢ型)和亞洲1型(Asia1型)等7個血清型和多種亞型，各血清型之間不能交叉保護，同一主要血清型內(nèi)各亞型間交叉保護力也較弱。FMDV滅活疫苗最早于20世紀20年代出現(xiàn)在歐洲，由動物組織經(jīng)氫氧化鋁吸附、甲醛滅活制成，但成本高、易散毒和免疫保護力低，因而未能推廣應(yīng)用。20世紀40年代,Schmidt和Waldman等將FMDV接種于健康牛舌內(nèi)，發(fā)病后取牛舌水皰皮和水皰液，經(jīng)甲醛滅活后制成鋁膠苗，獲得了較高的免疫保護力。1947年Frenkel首次用牛舌皮碎塊培養(yǎng)病毒獲得成功，生產(chǎn)了甲醛滅活疫苗。1962年Mowat和Chapman等開始用乳倉鼠腎細胞(BHK-21)培養(yǎng)口蹄疫病毒并制備滅活疫苗。1966年Lapstich和Telling等開始用BHK-21細胞深層懸浮培養(yǎng)法制備口蹄疫疫苗。20世紀80年代隨著大型發(fā)酵罐培養(yǎng)細胞和增殖病毒技術(shù)的成熟，病毒性疫苗生產(chǎn)進入了一個新的時代。我國于20世紀60年代起用OPK弱毒、OKIV毒株和OY/80毒株等經(jīng)滅活制成油佐劑疫苗。隨后O型口蹄疫滅活疫苗均是細胞培養(yǎng)滅活疫苗，常用的有OR株、onxc株、HK株、JMS株、OS株和制備濃縮苗的OZK毒株等[2-4]。

FMDV能在多種動物細胞內(nèi)增殖，包括原代細胞，如牛舌上皮細胞、牛甲狀腺細胞、牛胎皮膚-肌肉細胞、仔豬心肌細胞、豬腎細胞、倉鼠腎細胞、牛腎細胞和豚鼠腎細胞等，還有傳代細胞系，如犢牛甲狀腺細胞系、豬腎上皮細胞(PK-15)、仔豬腎上皮細胞 (IBRS-2)和倉鼠腎細胞(BHK-21)等，F(xiàn)MDV對原代細胞的敏感性雖然較傳代細胞好，但是其在原代細胞上達到的病毒含量低于傳代細胞系(原代細胞每0.1 g組織含1TCID50～5TCID50，傳代細胞中可達106TCID50～107.5TCID50)。此外，不同型毒株在同一細胞及同一毒株在不同細胞上的生長狀態(tài)有一定的差異[3]。犢牛甲狀腺細胞對FMDV最敏感，適于感染組織分離增殖病毒。FMDV在牛舌上皮細胞內(nèi)易于生長，24 h收獲病毒時，毒價可達106TCID50/mL～108TCID50/mL。IBRS-2細胞系和BHK-21細胞系常用于進行口蹄疫病毒的分離培養(yǎng)。口蹄疫病毒的培養(yǎng)技術(shù)主要為貼壁培養(yǎng)技術(shù)和懸浮培養(yǎng)技術(shù)，后者是FMDV大規(guī)模培養(yǎng)的主流模式[2,5-6]。

1 貼壁細胞培養(yǎng)

1.1 貼壁細胞的選擇

1935年Frenkl用牛、羊、豬的胚胎皮膚細胞來培養(yǎng)FMDV首次獲得成功，1947年在牛舌上皮細胞上增殖FMDV。1955年Sellers成功用豬腎細胞增殖FMDV。Mowat，Chaprnan和Capstick發(fā)現(xiàn)FMDV可以在倉鼠腎(BHK)細胞系上增殖[5]。FMDV不同的血清型對細胞適應(yīng)性不同，且該病毒各毒株間在細胞上的增殖能力也存在很大差異。如口蹄疫病毒O型和A型病毒的含量超過108.0TCID50/0.1 mL，C型感染滴度可達107.5TCID50/0.1 mL，Asia1型病毒可達106.0TCID50/0.1 mL～107.0TCID50/0.1 mL。O型病毒在豬腎細胞系上需8 h～9 h，其病毒滴度便達到最高，而該型某一分離株在BHK-21細胞上只需3.5 h，就能使全部細胞出現(xiàn)細胞病變(cytopathic effect,CPE)，另一克隆株產(chǎn)生CPE需6 h～12 h。

1.2 貼壁細胞的營養(yǎng)需求和培養(yǎng)條件

Dulbecco和Sanford等發(fā)明了用胰蛋白酶消化分離組織細胞的方法，建立單層細胞培養(yǎng)技術(shù)[7]。FMDV的單層細胞培養(yǎng)方法已廣泛用于口蹄疫的診斷和FMDV培養(yǎng)特性等研究中，優(yōu)缺點簡要概括如表1所示。

1.3 微載體細胞培養(yǎng)

1967年Van Wezel提出了“微載體”培養(yǎng)系統(tǒng)的新技術(shù)概念[8-9]，種類有液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。商品化微載體主要是固體微載體[8]，紙片載體也開始活躍在細胞大規(guī)模培養(yǎng)領(lǐng)域。微載體細胞培養(yǎng)法能實現(xiàn)細胞大規(guī)模培養(yǎng)，易于檢測和控制培養(yǎng)系統(tǒng)環(huán)境因素和細胞的生長情況，培養(yǎng)基利用率高，培養(yǎng)工藝放大較易，設(shè)備可系統(tǒng)化和自動化。表2對目前市場常用的幾種微載體的特點進行了對比。

細胞培養(yǎng)基選擇：天然培養(yǎng)基因其成分復雜，會影響某些產(chǎn)物表達和實驗結(jié)果的分析。自Eagle成功開發(fā)人工合成培養(yǎng)基，大大促進了細胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽、谷氨酰胺和其他一些輔助物質(zhì)，使用前需補加一定量的血清。原代細胞培養(yǎng)液和傳代細胞培養(yǎng)液組成成分基本相同，根據(jù)細胞生長狀態(tài)調(diào)整細胞培養(yǎng)液中血清含量。原代細胞培養(yǎng)液用量少，營養(yǎng)消耗慢，故應(yīng)保證培養(yǎng)液的新鮮。對貼壁細胞進行大規(guī)模培養(yǎng)，反應(yīng)器與細胞直接接觸的培養(yǎng)表面要求生物相容性和親水性較好，且反應(yīng)器具備耐高溫、耐高壓和在線滅菌等要求。同時，反應(yīng)器剪切效應(yīng)低、混合效率高、細胞生長環(huán)境穩(wěn)定、細胞貼壁性良好、細胞生長狀態(tài)容易被監(jiān)測和控制，反應(yīng)器培養(yǎng)工藝容易放大，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。

表1 貼壁細胞培養(yǎng)優(yōu)點和缺點

表2 幾種常用微載體的優(yōu)點、缺點

2 懸浮細胞培養(yǎng)

2.1 細胞系選擇

1951年Evans報道了細胞深層懸浮培養(yǎng)技術(shù)，1962年Copstick和Guillotean報道了BHK-21深層懸浮細胞培養(yǎng)法，包括自動調(diào)節(jié)pH、溫度及轉(zhuǎn)數(shù)和密閉循環(huán)式的培養(yǎng)等[10]。目前，用于懸浮培養(yǎng)的細胞系主要是BHK-21和IBRS-2細胞系。由于細胞對FMDV敏感性、感染滴度和培養(yǎng)難易有差異，國際上常用BHK-21細胞系懸浮培養(yǎng)FMDV。 FMDV不同血清型培養(yǎng)24 h時感染滴度有所不同，同一毒株在不同細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中生長特性也不盡相同，詳細見表3。

表3 FMDV不同型毒株的培養(yǎng)特性

2.2 懸浮培養(yǎng)營養(yǎng)條件和設(shè)備選擇

口蹄疫病毒細胞培養(yǎng)需加入血清，血清易發(fā)生外源微生物的污染，批次間容易產(chǎn)生較大差異。因此，馴化篩選動物細胞適應(yīng)低血清,甚至使用無血清培養(yǎng)基，成為懸浮細胞培養(yǎng)FMDV的研究熱點。表4列出了有血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基2種方法懸浮培養(yǎng)細胞的優(yōu)點與不足。

由于口蹄疫病毒生長特性，全懸浮細胞培養(yǎng)法更適于培養(yǎng)口蹄疫病毒。懸浮細胞培養(yǎng)法較貼壁培養(yǎng)法體現(xiàn)出諸多優(yōu)勢，見表5所示。

表4 懸浮細胞培養(yǎng)方法優(yōu)缺點

表5 貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)方法比較

懸浮培養(yǎng)用設(shè)備主要有攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、膜式生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)式細胞反應(yīng)器、波式生物反應(yīng)器和中空纖維生物反應(yīng)器等[11-13]。攪拌式生物反應(yīng)器機械攪動時產(chǎn)生的剪切力會損傷培養(yǎng)的細胞，添加血清蛋白成分可以減少損傷，因此較適合進行有血清懸浮培養(yǎng)口蹄疫病毒；氣升式生物反應(yīng)器較攪拌式生物反應(yīng)器剪切力降低，對細胞損傷減少，但在高密度規(guī)?；囵B(yǎng)細胞過程中，通氣過程會對細胞造成損傷；膜式生物反應(yīng)器降低了剪切力對細胞的損傷，避免了氣泡和流體剪切力的產(chǎn)生，故其較適合容易受到剪切力破壞的動物細胞的培養(yǎng)；中空纖維生物反應(yīng)器能夠持續(xù)供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)，因此不受營養(yǎng)物質(zhì)限制和有毒代謝產(chǎn)物積累的影響，且能在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞[14]。

3 小結(jié)與展望

雖然無血清懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)是大規(guī)模生產(chǎn)口蹄疫病毒理想目標，但是還存在諸多技術(shù)難題，如優(yōu)化細胞培養(yǎng)環(huán)境[15]、改變細胞特性、病毒修飾改造。此外，基因編輯技術(shù)[16]、細胞生物編程和細胞微環(huán)境改造，可為FMDV培養(yǎng)提供新的技術(shù)途徑。

3.1 基因編輯技術(shù)對FMDV的修飾

RNAi技術(shù)屬于基因下調(diào)(knockdown)方法，不具備完全去除基因的功能，屬于第1代基因編輯技術(shù)。鋅指酶ZFN(zinc finger nucleases)和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)技術(shù)屬于基因編輯的第2代技術(shù)，第3代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas已經(jīng)成為了基因組編輯的強大工具[17-19]。利用該基因編輯技術(shù)對FMDV基因進行改造和修飾，獲得生產(chǎn)性能高、抗原匹配性好、免疫應(yīng)答能力強和生物安全性好等特征的疫苗種子毒。此外，敲除或沉默F(xiàn)MDV某個基因片段，開發(fā)更安全的疫苗毒株，生產(chǎn)出滿足防疫要求的疫苗[20]。目前，基因編輯技術(shù)可以實現(xiàn)人工控制病毒復制，使疫苗研發(fā)不再復雜，在許多生物工程領(lǐng)域取得了突破性發(fā)展。

3.2 細胞生物編程和細胞微環(huán)境改造技術(shù)

誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)是2006年由日本京都大學山中伸彌(Yamanaka S)研究團隊首次獲得[21]。2007年，該日本研究小組和兩個美國研究小組將細胞再編程技術(shù)應(yīng)用到了人體細胞上，獲得人類iPSC[22-23]。iPSC技術(shù)自其誕生以來，主要集中在體細胞和重編程因子的選擇、重編程因子介導載體體系的建立、誘導轉(zhuǎn)化率的提升以及疾病特異性的iPSC模型的建立等方面。通過導入一些基因改變細胞生長周期的調(diào)控，可使細胞在無血清的培養(yǎng)基中生長，從而降低細胞培養(yǎng)污染風險和成本。

3.3 生產(chǎn)設(shè)施自動化控制工藝

隨著生物工程和組織工程學的發(fā)展，相應(yīng)的生物反應(yīng)器水平也在不斷提高?，F(xiàn)階段生物反應(yīng)器設(shè)計平臺建立了計算機實時監(jiān)測與控制技術(shù)[24]，通過檢測培養(yǎng)過程中細胞耗氧速率的變化，對培養(yǎng)過程中生理生化關(guān)鍵參數(shù)進行監(jiān)測和控制，如細胞濃度、溫度、pH和溶解氧濃度等參數(shù)，以及代謝產(chǎn)物檢測、OUR等[25]，為動物細胞工業(yè)化培養(yǎng)過程的自動化實時監(jiān)測和控制奠定了基礎(chǔ)。

生產(chǎn)口蹄疫疫苗關(guān)鍵因素在于獲得高濃度、成本低的病毒抗原。無血清懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)可以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和降低生產(chǎn)成本?；蚓庉嫾夹g(shù)通過病毒修飾、細胞適應(yīng)性的修改，獲得免疫原性高、增殖性能優(yōu)良的種子毒，能適應(yīng)不同血清型病毒增殖的通用型細胞株。此外，針對細胞生長的微環(huán)境，研究成本更低的培養(yǎng)基和配套的自動化設(shè)施，以此可以降低口蹄疫病毒生產(chǎn)成本。

[1] 劉湘濤.口蹄疫[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2015:271-273.

[2] 滕家蕊.口蹄疫新型疫苗研究進展[J].福建畜牧獸醫(yī)，2016,38(6)：34-36.

[3] 李世芳，邵軍軍，常惠蕓.口蹄疫表位疫苗的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2017，44(2)：396-401.

[4] 高佃平.口蹄疫合成肽疫苗研究新進展[J].畜牧獸醫(yī)，2015(3):25-26.

[5] 劉 磊.家畜口蹄疫防制[M].北京:金盾出版社,2010：25-30.

[6] 劉建福，胡位榮.細胞工程[M].湖北武漢：華中科技大學出版社,2014.

[7] 譙小燕，宋志剛，哈斯畢力格，等.紙片微載體培養(yǎng)BHK-21(C-13)細胞制備獸用狂犬凍干活疫苗[J].中國獸藥雜志，2013，47(5):42-45.

[8] 李 群.動物細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在獸用疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(6):236-239.

[9] 佛生福，馬 祺，王 丹，等.我國BHK-21細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫疫苗的進展[J].西北民族大學學報:自然科學版，2016，37(2):70-71.

[10] Agabalyan N A,Borys B S,Sparks H D,et al.Enhanced expansion and sustained inductive function of skin-derived precursor cells in computer-controlled stirred suspension bioreactors[J].Stem Cell Transl Med,2016,5(9):1033-1038.

[11] 嚴 石.懸浮培養(yǎng)技術(shù)在獸用疫苗領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)雜志，2016,53(3):76-78.

[12] Mizukami A,Fernandes-Platzgummer A,Carmelo J G,et al.Stirred tank bioreactor culture combined with serum-/xenogeneic-free culture medium enables an efficient expansion of umbilical cord-derived mesenchymal stem/stromal cells[J].J Biotechnol,2016,11(8):1048-1059.

[13] Berry J D,Liovic P,Sutalo I D,et al.Characterisation of stresses on microcarriers in a stirred bioreactor[J].Appl Mathemat Model,2016,40(15-16):6787-6804.

[14] de Soure A M,Fernandes-Platzgummer A,Da S C,et al.Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells[J].J Biotechnol,2016,236:88-109.

[15] Wang T,Green R,Nair R R,et al.Surface acoustic waves (SAW)-based biosensing for quantification of cell growth in 2D and 3D cultures[J].Sensors,2015,15(12):32045-32055.

[16] Liu H,Zeng F,Zhang M,et al.Emerging landscape of cell penetrating peptide inreprogramming and gene editing[J].J Contro Release,2016,226(2):124-137.

[17] Gagnon J A,Valen E,Thyme S B,et al.Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs[J].PLoS One,2014,9(5):e98186.

[18] Savitskaya E E,Musharova O S,Severinov K V.Diversity of CRISPR-Cas-mediated mechanisms of adaptive immunity in prokaryotes and their application in biotechnology[J].Biochemistry,2016,81(7):653-661.

[19] Sessions J W,Skousen C S,Price K D,et al.CRISPR-Cas9 directed knock-out of a constitutively expressed gene using lance array nanoinjection[J].Springerplus,2016,5(1):1521-1532.

[20] Lin C Y,Su Y H.Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system[J].Dev Biol,2016,409(2):420-428.

[21] Chamberlain S J.Disease modelling using human iPSCs[J].Human Molecul Genet,2016,25(2):173-181.

[22] Chari S,Mao t,Timeline:iPSCs-the first decade[J].Cell Stem Cell,2016,18(2):294.

[23] Lieberman R,Kranzler H R,Levine E S,et al.Examining FKBP5 mRNA expression in human iPSC-derived neural cells[J].Psychiat Res,2017,247:172-181.

[24] Nunes P S.Real-time direct cell concentration and viability determination using a fully automated microfluidic platform for standalone process monitoring[J].Analyst,2015,140(12):4007-4020.

[25] 王譽樹.生物反應(yīng)器智能測控系統(tǒng)的研制[D].浙江杭州：杭州電子科技大學,2014.