劉瑞琪，王瑋瑋，屈鵬祥，馬曉楠，王勇勝，卿素珠

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

成纖維生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)家族，又稱為肝素親和生長因子(heparin binding growth factor,HBGF)，是一類能促進成纖維細胞生長的多肽類活性物質(zhì)，約有23種，大多數(shù)與肝素結(jié)合發(fā)揮作用[1]。 FGF對于細胞生長、分化是重要的調(diào)控因子；可維持早期胚胎發(fā)育和器官形成的祖細胞，并且調(diào)節(jié)它們的生長、分化,構(gòu)成特定的組織；高度限制在特殊細胞亞型的特殊發(fā)育階段；可促進細胞有絲分裂、趨化與血管生成、促進中胚層和神經(jīng)外胚層細胞的存活與生長等[2]。

成纖維生長因子4是屬于FGF4亞型因子，它可分泌帶有切割的N-端信號肽的蛋白，通過旁分泌分泌到細胞外，結(jié)合和激活FGF受體(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)引起生物反應(yīng)。研究表明，F(xiàn)GF4在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。早在1994年，Rappolee等研究發(fā)現(xiàn)FGF4 mRNA是母源型轉(zhuǎn)錄因子[3]。近年的研究表明，在小鼠早期胚胎發(fā)育過程中，F(xiàn)GF4特異性的分布于內(nèi)細胞團中，調(diào)控內(nèi)細胞團分化為外胚層和原始內(nèi)胚層，決定外胚層和原始內(nèi)胚層的分布比例[4]，并且調(diào)控著外胚層和胚外外胚層交流的誘導(dǎo)信號[5]。隨著研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)FGF4突變的小鼠胚胎在植入前死亡，可能是因為FGF4的異常表達干擾了早期胚胎發(fā)育過程中內(nèi)細胞團的生長[6]。此外，有研究表明,敲除FGF4基因的小鼠也將導(dǎo)致胚胎植入后流產(chǎn)[7]，分析認為FGF4的異常表達影響了小鼠胎盤的發(fā)育及功能[8]。以上研究結(jié)果表明，F(xiàn)GF4是小鼠早期胚胎發(fā)育過程中一個重要因子，異常表達會影響早期胚胎的發(fā)育。目前，有關(guān)FGF4在牛早期胚胎發(fā)育過程中的分布及功能意義尚未見報道，本研究通過實時熒光定量PCR和免疫熒光染色技術(shù)，對FGF4在牛早期胚胎發(fā)育各個階段的表達和定位規(guī)律進行研究，為探討其在牛早期胚胎發(fā)育過程中可能的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 試驗所用牛卵巢，采自西安市某屠宰場；冷凍精子，購自上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒Cells-to-signal Kit，Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA synthesis kit，TaKaRa公司產(chǎn)品；熒光定量試劑盒SYBR Premix ExTaq，Promega公司產(chǎn)品；兔源Anti-FGF4多克隆抗體(ab106355)，Abcam公司產(chǎn)品；Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG二抗、免疫染色固定液、封閉液一抗、二抗稀釋液和DAPI等，碧云天公司產(chǎn)品。采卵液、卵母細胞成熟液、精子獲能受精液、胚胎體外培養(yǎng)液，按照文獻配制[9]。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞的收集 采集的牛卵巢存放于含有100 mg/L鏈霉素、20 U/L青霉素的37℃生理鹽水的恒溫瓶中，4 h～6 h內(nèi)送回實驗室。生理鹽水洗滌3次后，去除卵巢表面的附屬組織，用12號針頭注射器采用抽吸法抽吸卵巢表面的卵泡，將抽吸出的卵泡液置于直徑60 mm平皿中，體視顯微鏡下收集卵丘-卵母細胞復(fù)合體(cumulus oocyte complexes,COCs)，在采卵液中洗滌3次，選取卵丘細胞包裹較好且胞質(zhì)均勻的COCs放入卵母細胞成熟液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為38.5℃、體積分數(shù)為5%的CO2。

1.2.2 體外受精胚胎的收集 COCs在培養(yǎng)22 h～24 h后，利用移液槍吹吸數(shù)次，使顆粒細胞呈松散狀，挑選帶有第一極體的成熟卵母細胞在精子獲能受精液中洗滌3次，收取10個MⅡ期(Metaphase Ⅱ)卵母細胞備用，然后將剩余卵母細胞放至精子獲能受精液的微滴中(用礦物油覆蓋)進行后續(xù)試驗。提前將6 mL的精子獲能受精液置于15 mL的離心管中，傾斜放置于38.5℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱平衡8 h以上。將冷凍精子在38℃水浴中解凍，用玻璃吸管將其緩緩注入平衡好的精子獲能受精液的離心管底部，之后45°傾斜離心管，于38.5℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱靜置45 min，使得精子能夠自由上浮，吸取上清液部分，置于新的15 mL離心管中1 000 r/min離心10 min，棄上清，保留其底部200 μL的液體輕輕混勻，移入含有成熟卵母細胞的微滴中，在38.5℃、體積分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)10 h～14 h。將受精的卵母細胞用10 g/L透明質(zhì)酸酶完全清除顆粒細胞層后，移至胚胎體外培養(yǎng)液中洗滌3次，而后移到預(yù)先平衡4 h～6 h的胚胎體外培養(yǎng)液的微滴中，每個微滴放置約50個受精卵，在38.5℃、體積分數(shù)為5%的CO2中培養(yǎng)。在24、48、72、120、168 h分別收取2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑椹胚和囊胚期的胚胎。

1.2.3 總RNA提取及cDNA合成 分別收取各時期的早期胚胎10個，按照RNA提取試劑盒Cells-to-signal Kit說明書提取胚胎總RNA，取不同時期胚胎的RNA 2 μg ，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA synthesis kit說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-20℃保存。

1.2.4 實時熒光定量PCR 根據(jù)GenBank中公布的牛cDNA序列，利用Primer 5.0設(shè)計特異性引物(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以各時期的胚胎cDNA為模板進行實時熒光定量PCR，反應(yīng)體系：上、下游引物(0.2 mmol/L)各0.4μL，模板cDNA 2μL，SYBR○RPremix ExTaqTM Ⅱ 10μL，Passive ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL, ddH2O 6.8μL，總反應(yīng)體系為20μL。每個樣品重復(fù)3次，使用Step One real-time PCR system (Step One and Step One Plus;ABI)進行RT-PCR，反應(yīng)程序：95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，通過2-△△Ct法計算FGF4的相對表達量。

表1 試驗所用引物序列

1.2.5 免疫熒光染色 各時期胚胎經(jīng)免疫染色固定液固定2 h，用PBS-PVA洗滌5 min×3。 3 mL/L Triton X-100室溫透化30 min，PBS-PVA洗滌5 min×3。封閉液4℃過夜，PBS-PVA洗滌5 min×3。加入FGF4一抗(工作濃度1∶200)，4℃過夜孵育，PBS-PVA洗滌5 min×3。加入Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG二抗(工作濃度1∶1 000)，避光室溫孵育2 h～4 h，PBS-PVA洗滌5 min×3，DAPI 染5 min，PBS-PVA洗5 min×3；抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并照相。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及分析 所有試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)通過SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 FGF4 mRNA在牛早期胚胎發(fā)育過程中的表達

不同時期牛早期胚胎中FGF4 mRNA的表達情況見圖1。由圖1可知，F(xiàn)GF4 mRNA在牛MⅡ期卵母細胞及早期胚胎的各階段均有表達，相比于MⅡ期卵母細胞，F(xiàn)GF4 mRNA的表達量在2-細胞胚顯著下降，隨后持續(xù)增加，但在4-細胞胚時FGF4 mRNA的表達量仍低于MⅡ期卵母細胞，8-細胞胚時FGF4 mRNA的表達量已顯著高于MⅡ期卵母細胞，至桑椹胚期FGF4 mRNA的表達量達到峰值，而后在囊胚期表達量顯著下降、但仍高于8-細胞期及之前各時期胚胎中的表達量。

2.2 FGF4在牛早期胚胎中的分布規(guī)律

FGF4陽性反應(yīng)呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光。不同階段牛早期胚胎FGF4的分布情況見圖2。由圖2可知，F(xiàn)GF4蛋白在牛MⅡ期卵母細胞及各時期的早期胚胎中均有表達，但在不同時期胚胎的定位及反應(yīng)強度有所不同。在MⅡ期卵母細胞、2-細胞胚及4-細胞胚，F(xiàn)GF4在卵母細胞及卵裂球的細胞質(zhì)和細胞核中均有表達。而在8-細胞胚及桑椹胚，F(xiàn)GF4主要定位于卵裂球的胞質(zhì)，而細胞核中未見陽性反應(yīng)。至囊胚階段，F(xiàn)GF4在內(nèi)細胞團及滋養(yǎng)層細胞中均有表達，尤以內(nèi)細胞團的反應(yīng)更強，且主要定位于細胞質(zhì)。

MⅡ.MⅡ卵母細胞；2-cell.2-細胞胚；4-cell.4-細胞胚；8-cell.8-細胞胚；M.桑椹胚；B.囊胚

MⅡ.MⅡoocytes,2-cell.2-cell stage；4-cell.4-cell stage；8-cell.8-cell stage；M.Morula；B.Blastocyst

圖1 FGF4 mRNA在牛早期胚胎中的相對表達量

Fig.1 Relative expressional amount of FGF4 mRNA in bovine early stage embryos

3 討論

Rappolee D A等[3]發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎中FGF4從MⅡ期卵母細胞至囊胚階段均有表達，其在2-細胞期表達量有所下降，在囊胚期高度表達，認為FGF4是一種母源性轉(zhuǎn)錄因子。在哺乳動物中，精子染色質(zhì)與卵母細胞染色質(zhì)融合，形成合子基因組，合子型基因激活并轉(zhuǎn)錄，最終獲得發(fā)育的全能性[10]。而在合子型基因激活前，細胞分裂受母源性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，受精卵中儲存著大量的母源mRNA、蛋白質(zhì)、細胞器，這些物質(zhì)合成更多的細胞因子，支持并指導(dǎo)早期胚胎的發(fā)育。在此過程中母源物質(zhì)逐步消耗，直到合子型基因被激活，合子型基因的適時表達并完全取代母源基因，以實現(xiàn)胚胎發(fā)育由母源型調(diào)控向合子型調(diào)控的過渡。而缺少這一過程的動物胚胎無法進一步發(fā)育，胚胎發(fā)育受到阻滯,這表明母源型調(diào)控向合子型調(diào)控的轉(zhuǎn)變對胚胎發(fā)育至關(guān)重要。值得注意的是，研究表明大部分母源因子，在合子型基因轉(zhuǎn)錄激活后仍表達，而且缺失這些母源因子對胚胎是致死性的[11]。然而，不同物種由母源性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控向合子型基因調(diào)控過渡的時期不同，小鼠的合子激活期為2-細胞胚胎晚期[12-13]，牛的合子激活期為4-細胞胚晚期或8-細胞時期[14]，這使得一些基因在小鼠和牛胚胎中的表達有所不同，并且同一個基因在合子激活前后表達亦有所不同。本研究通過qRT-PCR檢測FGF4在牛早期胚胎中的表達規(guī)律，結(jié)果顯示FGF4在牛的MⅡ期卵母細胞及各階段的早期胚胎均有表達，與MⅡ期卵母細胞相比，2-細胞胚FGF4 mRNA表達量顯著下降，隨后持續(xù)增加，直至8-細胞期表達量顯著高于MⅡ期卵母細胞，至桑椹胚階段FGF4的表達量最高。這種表達規(guī)律可能是因為合子型基因激活前，母源因子FGF4維持了這段時期的細胞分裂，消耗其表達。但隨著合子型基因的激活，F(xiàn)GF4的表達也得到了提高。

圖2 FGF4在不同時期牛早期胚胎的分布

胚胎中細胞的分布決定細胞命運和極性[15]，母源因子在胚胎極性形成時發(fā)揮重要作用，8-細胞期獲得極性是決定細胞命運的關(guān)鍵時期[16]。本研究結(jié)果表明FGF4在MⅡ期卵母細胞及8-細胞期前的各階段早期胚胎的細胞質(zhì)和細胞核中均有表達，而在8-細胞期及之后的桑椹胚和囊胚期FGF4只在細胞質(zhì)中表達，這可能是因為FGF4在胚胎發(fā)育中與胚胎發(fā)育極性相關(guān)，然而FGF4在牛胚胎中遷移具體的機制仍需進一步研究。在小鼠囊胚中，F(xiàn)GF4特異性表達在內(nèi)細胞團中，是形成功能性內(nèi)細胞團所必須的[3,17]，通過影響種系特異性基因的分布，調(diào)控內(nèi)細胞團分化原始內(nèi)胚層的過程[18]。而本研究結(jié)果表明，牛囊胚中FGF4在內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層中均有表達，并在內(nèi)細胞團中表達水平較高，這與Takashi F及Manabu O的研究結(jié)果一致[19-20]。這可能是因為FGF4是一種分泌型蛋白，內(nèi)細胞團能夠分泌FGF4并通過旁分泌方式作用于滋養(yǎng)層細胞，其斷裂的N端信號多肽通過結(jié)合并激活FGFRs作為細胞外蛋白介導(dǎo)生物反應(yīng)，可與細胞溶質(zhì)接頭蛋白和RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ和STAT胞內(nèi)信號旁路相互作用，從而進一步影響滋養(yǎng)層的增殖。另有研究表明，在胚胎附植后FGF4將調(diào)控功能性內(nèi)細胞團的形成，并影響滋養(yǎng)層部分發(fā)育為胎盤組織的過程[7,21-22]。

本研究從mRNA和蛋白水平觀察了FGF4在牛MⅡ卵母細胞及各階段早期胚胎的表達模式，首次確定了FGF4在牛早期胚胎發(fā)育過程中的時空表達規(guī)律，為進一步研究FGF4基因在牛早期胚胎發(fā)育過程中的調(diào)控機制提供了依據(jù)。

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