梅 晨，李淑芳，徐玉智，張培君，龔玉梅，王宏俊

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097)

副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)是雞傳染性鼻炎的致病菌，該菌培養(yǎng)條件較為苛刻，需要在培養(yǎng)基中加入煙堿腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)和血清，培養(yǎng)時(shí)需厭氧環(huán)境或在體積分?jǐn)?shù)為3%～10%的CO2環(huán)境。本病廣泛分布于世界各地，潛伏期短，傳播迅速，短時(shí)間內(nèi)便可波及全群[1]。目前對(duì)該菌鑒定常用的靶基因是16 S rRNA，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)已成為病原菌檢測(cè)和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。副雞禽桿菌的生化反應(yīng)復(fù)雜，不同毒力的菌株會(huì)有不同的結(jié)果；間接血凝試驗(yàn)雖是目前最準(zhǔn)確有效的方法，但此方法用時(shí)較長(zhǎng)；PCR雖然特異性強(qiáng)，但是需要的PCR擴(kuò)增儀昂貴。2000年Notomi T等[2]發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用鏈置換型DNA聚合酶，能在等溫條件下 (60℃～65℃ )，1 h內(nèi)特異地?cái)U(kuò)增出109～1010拷貝靶序列，擴(kuò)增結(jié)果可直接對(duì)擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀通過肉眼進(jìn)行判斷或檢測(cè)其濁度，也可用結(jié)合雙鏈的熒光染料優(yōu)選 SYBR Green Ⅰ染色，即可通過肉眼判定。在保持傳統(tǒng)PCR優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了反應(yīng)的特異性，同時(shí)縮短了檢測(cè)時(shí)間。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在疾病的快速檢測(cè)方面發(fā)展迅速，已廣泛用于對(duì)細(xì)菌、病毒、寄生蟲的檢測(cè)和動(dòng)物胚胎性別鑒定等領(lǐng)域[3-11]，是很有發(fā)展前景的快速診斷方法之一。

本研究針對(duì)副雞禽桿菌保守基因16 S rRNA設(shè)計(jì)LAMP引物，優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)副雞禽桿菌的LAMP，并對(duì)該方法的特異性和靈敏度進(jìn)行分析比較。

1 材料與方法

1.1 材料

副雞禽桿菌3個(gè)血清型的標(biāo)準(zhǔn)株，A型的0083、B型的0222、C型的Modsto以及10株國(guó)內(nèi)分離株，北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存，參考天根生物公司基因組DNA提取試劑盒說明書提取該菌基因組用作后續(xù)試驗(yàn)的模板；14株非副雞禽桿菌病原微生物如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)副雞禽桿菌16 S rRNA基因(GenBank：BG577820.1)參考序列，用Clustal W進(jìn)行多重比對(duì)，對(duì)保守區(qū)域序列進(jìn)行分析，確保擴(kuò)增的特異性。用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4.0設(shè)計(jì)特異引物序列，引物由生工生物工程(北京)有限公司合成。設(shè)計(jì)2組引物，外引物F3：5′-CAAGCGGTGGAGCATGTG-3′，B3：5′-ATCACTGGCAGTCTCCTTTG-3′；內(nèi)引物FIP：5′-CTAAGCTCCCGAAGGCACTCCGATGCAACGCGAAGAACCT-3′，BIP：5′-TGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAACGAAGTGCTGGCAACAAAG-3′。

表1 菌(毒)株及其編號(hào)

1.2.2 LAMP反應(yīng)體系的建立 不同反應(yīng)溫度的優(yōu)化，25 μL LAMP反應(yīng)體系包括：Apg基因組DNA 2 μL～3 μL，20 mmol/L Tris-HCl(pH8.8,25℃)，10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，1 mL/L的TritonR X-100，0.8 mol/L甜菜堿(betaine)，8 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTPs，8 000 U/mLBstDNA polymerase 1.0 μL，加入的引物量為5 pmol F3和B3，40 pmol FIP和BIP；參照文獻(xiàn)資料[12-14],反應(yīng)條件為分別置于61.0、62.0、63.0、64.0、65.0、 66.0、67.0℃的恒溫環(huán)境中60 min，并在80℃持續(xù)10 min，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 LAMP靈敏度的評(píng)價(jià) 將培養(yǎng)后的細(xì)菌提取DNA ( 原始核酸含量為1.7×106pg) 進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行LAMP和PCR檢測(cè)，其中PCR引物為L(zhǎng)AMP的外引物(F3和B3)。LAMP反應(yīng)體系為:10×LAMP buffer 2.5 μL，F(xiàn)3(5 pmol/μL)1 μL，B3(5 pmol/μL)1 μL，F(xiàn)IP(40 pmol/μL)1 μL，BIP(40 pmol/μL)1 μL，BstDNA聚合酶1 μL，dNTPs(10 mmol/L)3.5 μL，待檢樣品DNA 2 μL，無菌去離子水12 μL。上述反應(yīng)體系配制于PCR管中，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照；LAMP反應(yīng)條件：將上述配置完成的含反應(yīng)體系的PCR管混勻后瞬時(shí)離心，置于水浴鍋中65℃反應(yīng)60 min，并在80℃持續(xù)10 min，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；PCR反應(yīng)體系為:2×TaqPCR star Mix(GenStar)12.5 μL，F(xiàn)3(10 mmol/L)1 μL，B3(10 mmol/L)1 μL，待檢DNA樣品2 μL，無菌去離子水8.5 μL。上述反應(yīng)體系配制于PCR管中，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照；PCR反應(yīng)條件：將上述配置完成的含反應(yīng)體系的PCR管混勻后離心，PCR檢測(cè)體系擴(kuò)增參數(shù)具體為：94℃ 5 min;94℃ 20 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s,共32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)，用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 LAMP的特異性 用上述LAMP對(duì)14株非副雞禽桿菌的病原微生物進(jìn)行特異性評(píng)估，將試驗(yàn)菌株復(fù)蘇培養(yǎng)后提取基因組DNA，按上述LAMP進(jìn)行檢測(cè)，65℃反應(yīng)60 min。

2 結(jié)果

2.1 最適反應(yīng)溫度的確定

設(shè)置了7個(gè)溫度梯度，由圖1可以看出，陽性都呈現(xiàn)出典型的特異性梯狀條帶，說明61.0℃～67.0℃溫度下都能進(jìn)行反應(yīng)，而陰性則無此現(xiàn)象，所以選擇65.0℃作為后續(xù)試驗(yàn)的反應(yīng)溫度。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～7.61.0、62.0、63.0、64.0、65.0、66.0、67.0℃;8.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 5 000;1-7.61.0,62.0,63.0,64.0,65.0,66.0,67.0℃;8.Negative control

圖1 LAMP最佳溫度篩選

Fig.1 The best temperature screening of LAMP reaction system

2.2 靈敏度的評(píng)價(jià)

設(shè)置了不同濃度的DNA梯度，LAMP的電泳檢測(cè)結(jié)果見圖2，呈現(xiàn)出典型的特異梯形條帶，在第9條泳道可看到較清晰的條帶，所對(duì)應(yīng)DNA濃度為0.17 pg/管，而第10條泳道之后完全看不到擴(kuò)增條帶；PCR的電泳檢測(cè)結(jié)果見圖3，在第7條泳道可以看到略暗的條帶，所對(duì)應(yīng)DNA濃度為56 pg/管，而第8條泳道完全看不到擴(kuò)增條帶。綜上結(jié)果，本試劑盒的LAMP最低檢出限0.17 pg/反應(yīng)，PCR的最低檢出限56 pg/反應(yīng)，說明本檢測(cè)方法具有較高的靈敏度和應(yīng)用價(jià)值。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.陽性對(duì)照;2～10.1.7×106、1.7×105、1.7×104、1.7×103、1.7×102、1.7×101、1.7×100、1.7×10-1、1.7×10-2pg/管；11.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 5 000;1.Positive control;2-10.1.7×106,1.7×105,1.7×104,1.7×103,1.7×102,1.7×101,1.7×100,1.7×10-1,1.7×10-2pg/tube；11.Negative control

圖2 LAMP內(nèi)引物靈敏度試驗(yàn)

Fig.2 The sensitivity test of LAMP by using inner primer

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～8.1.7×106、1.7×105、1.7×104、1.7×103、1.7×102、1.7×101、1.7×100pg/管；9.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 5 000;1-8.1.7×106,1.7×105,1.7×104,1.7×103,1.7×102,1.7×101,1.7×100pg/tube；9.Negative control

圖3 LAMP外引物靈敏度試驗(yàn)

Fig.3 The sensitivity test of LAMP by using outer primer

2.3 特異性驗(yàn)證

選取了14株非副雞禽桿菌病原微生物和10株副雞禽桿菌分離株、3株標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行特異性評(píng)估試驗(yàn)，結(jié)果見圖4和圖5，只有副雞禽桿菌顯示出特異性擴(kuò)增，非副雞禽桿菌無特異性條帶。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～10.分離株；11.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 5 000;1-10.Avibacteriumparagallinarumisolates；11.Negative control

圖4不同副雞禽桿菌分離株LAMP產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig.4 Electrophoresis of LAMP products of different strains ofAvibacteriumparagallinarum

3 討論

LAMP作為一種新型的恒溫檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、不需要特殊試劑和儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，所以在臨床疾病診斷、微陣列基因芯片的開發(fā)及食品衛(wèi)生質(zhì)量檢驗(yàn)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[13-15]。目前，在LAMP反應(yīng)不開蓋的前提下，其結(jié)果判定方式有目視檢查渾濁、目視檢查染料顏色變化和濁度儀對(duì)LAMP反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控這3種方法[16]。其中目視檢查渾濁法主要依據(jù)LAMP反應(yīng)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀而使反應(yīng)液呈現(xiàn)渾濁，但是當(dāng)渾濁度較低時(shí)，肉眼很難察覺。用實(shí)時(shí)濁度儀可以更加直觀、準(zhǔn)確地判定結(jié)果，但是需要使用特定的儀器設(shè)備。相比較而言，染料比色分析既提高了肉眼的識(shí)別率，又可直接用于疫病的現(xiàn)場(chǎng)診斷，是最為簡(jiǎn)單方便的判定方式。普遍用于LAMP的常用染料主要有SYBR Green Ⅰ、溴化乙錠(EB)、Picogreen、鈣黃綠素和HNB等，其中以SYBR Green Ⅰ和HNB的檢測(cè)靈敏性最高，是鈣黃綠素的10倍[16]。

本研究所用的13株副雞禽桿菌都擴(kuò)增出LAMP的特異性梯形條帶，而非副雞禽桿菌的14種禽病病原，包括細(xì)菌和病毒，都未能擴(kuò)增出LAMP陽性結(jié)果，說明該方法具有很好的特異性；將副雞禽桿菌的基因組做10倍梯度稀釋后用LAMP和PCR進(jìn)行檢測(cè)來比較兩者敏感性，結(jié)果表明，LAMP檢出的最低限量是常規(guī)PCR的1/300。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1～3.0083、0222、Modesto副雞禽桿菌標(biāo)準(zhǔn)株；4～17.禽多殺性巴氏桿菌、雞腸球菌、副溶血性弧菌、單核增生李斯特菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲桿菌、肺炎克雷伯菌、枯草芽胞桿菌、雞白痢沙門菌、禽流感病毒、雞毒支原體、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒；18.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 5 000;1-3.0083，0222 and Modesto as three standard strains ofAvibacteriumparagallinarum; 4-17.Pasteurellamultocida,ChickenEnterococcus,Vibrioparahemolyticus,Listeriamonocytogenes,Escherichiacoli,Staphylococcusaureus,Campylobacterjejuni,Klebsiellapneumoniae,Bacillussubtilis,Salmonellapullorum,Avian influenza virus,Mycoplasmagallisepticum,Infectious bronchitis virus,Infectious laryngotracheitis virus;18.Negative control

圖5 3株副雞禽桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和14株其他病原標(biāo)準(zhǔn)株的LAMP產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig.5 The electrophoretic result of three standard strains of LAMP products ofAvibacteriumparagallinarumand 14 other different pathogen standard strains

本研究建立的LAMP優(yōu)勢(shì)在于：高效快捷，可于60 min內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)；靈敏度高，DNA樣品的檢測(cè)閾值為0.17 pg；適用范圍廣，不需要PCR儀等昂貴設(shè)備，僅用水浴鍋或者保溫杯即可實(shí)現(xiàn)該檢測(cè)過程；此方法在顯著提高靈敏度的同時(shí)大大降低了成本。下一步將把染料比色分析優(yōu)化到該方法中，以便于肉眼的識(shí)別，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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