沈文康，謝芝勛，王 盛，黃 莉，謝麗基，黃嬌玲，曾婷婷，張艷芳，張民秀，羅思思，范 晴，謝志勤，鄧顯文

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

禽呼腸病毒(Avian reovirus，ARV)是呼腸病毒科、正呼腸病毒屬的成員，為雙鏈RNA病毒，無囊膜，含10個(gè)節(jié)段，雙衣殼結(jié)構(gòu)，可感染雞、火雞、鵝、鴨及一些鳥類[1]，臨床主要癥狀包括病毒性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、腸道病、矮小綜合征、吸收不良綜合征及免疫抑制等，是家禽養(yǎng)殖業(yè)中一類重要的傳染病，嚴(yán)重危害著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2]。

ARV于1954年由Fahey和Crawley從病雞中分離得到[3]；Olson等于1957年報(bào)道雞群中有滑膜炎并分離出病原，1972年被確定為禽呼腸病毒[4]。自20世紀(jì)80年代以來，我國各省份及地區(qū)陸續(xù)報(bào)道了ARV感染的疫情，對ARV的研究也日漸深入，Vanderheide等用ARV S1133株生產(chǎn)出了第一代的商品化活疫苗應(yīng)用于生產(chǎn)[5]；2012年起，我國ARV感染疫情逐漸擴(kuò)大，主要癥狀也呈現(xiàn)復(fù)雜化、多樣化。目前，養(yǎng)殖場普遍存在ARV感染，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。研究表明，ARV的細(xì)胞親嗜性較廣，能在綠猴腎細(xì)胞(Vero)、犬腎細(xì)胞(MDCK)、雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)、乳地鼠細(xì)胞(BHK-21/13)等多種細(xì)胞系中增殖，且產(chǎn)生穩(wěn)定典型細(xì)胞病變[6]。丁明洋等[7]用鴨呼腸病毒TH11感染BHK-21細(xì)胞后可有效增殖，出現(xiàn)了穩(wěn)定病變；黃莉等[8]用ARV強(qiáng)、弱毒株分別接種Vero細(xì)胞，并分析了接毒后細(xì)胞蛋白表達(dá)的差異；余愛花等[9]研究了3株鴨源ARV對鴨胚成纖維細(xì)胞的致病性，分析了接毒后細(xì)胞TNF-α表達(dá)水平的差異性。

有關(guān)ARV的研究已經(jīng)較為深入，但研究ARV在DF1細(xì)胞上的增殖特性還未見報(bào)道，本文就此展開研究。通過將ARV S1133毒株接種DF1細(xì)胞，研究其增殖特性，旨在為下一步ARV致病機(jī)理的研究和細(xì)胞滅活苗的研制奠定技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、2.5 g/L胰酶,Gibco公司產(chǎn)品；PBS，Solarbio公司產(chǎn)品；禽呼腸S1133標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；DF1細(xì)胞，由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 參考NCBI上的ARV S1133株S2基因的核苷酸序列(登錄號：KF741763.1)，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由華大基因公司合成，引物序列見表1。

1.2.2 ARV S1133接種DF1細(xì)胞 將ARV S1133接種至生長良好的DF1細(xì)胞上，37℃孵育2h，更換維持液(含20 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基)，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2中37℃培養(yǎng)，觀察CPE。培養(yǎng)3 d后收細(xì)胞培養(yǎng)物，置-80℃凍存?zhèn)溆?。取上述病毒液再接種細(xì)胞，培養(yǎng)3 d后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，重復(fù)接毒3次。置-80℃凍存?zhèn)溆?，測定第3代細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒滴度。

表1 ARV S2基因的核苷酸序列

1.2.3 RT-PCR檢測 收獲接毒后培養(yǎng)48 h的第3代細(xì)胞培養(yǎng)物，提取病毒RNA，用ARV通用引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將其作為模板用表1中的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 248 bp。PCR程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 70 s，循環(huán)數(shù)為35；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 一步生長曲線的繪制 將上述收獲的第3代病毒液接種DF1細(xì)胞，分別收取接毒后12、24、36、48、72、96、120 h的病毒液，置-80℃凍存?zhèn)溆?。將DF1細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞板上，在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2中37℃過夜培養(yǎng)，觀察CPE及記錄CPE孔數(shù)(重復(fù)此過程3次)。按Reed-Meunch法計(jì)算7個(gè)時(shí)間段的半數(shù)組織感染量(TCID50)(取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值)，繪制ARV在DF1細(xì)胞上的一步生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞病變

接毒12 h后即可觀察到CPE，在48 h時(shí)最明顯，主要細(xì)胞病變?yōu)榧?xì)胞萎縮、破碎，脫落，成團(tuán)，邊緣不清晰，個(gè)別胞體出現(xiàn)變大，死亡等特征，對照組細(xì)胞生長良好(圖1)。

A.正常；B.接毒后24 h；C.接毒后48 h；D.接毒后72 h

A.Normal；B.Post-infection 24 h；C.Post-infection 48 h；D.Post-infection 72 h

圖1 DF1細(xì)胞形態(tài)(400×)

Fig.1 Morpha of DF1 cells(400×)

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

收取接種ARV S1133株的第3代DF1細(xì)胞培養(yǎng)物，用RT-PCR檢測。結(jié)果擴(kuò)增到一條1 248 bp大小片段(圖2)。對片段序列與所選的參考株同源性在99.99%以上，說明ARV S1133毒株在DF1細(xì)胞上增殖。

2.3 ARV S1133毒株在DF1細(xì)胞系上的增殖規(guī)律

ARV S1133接種DF1細(xì)胞后，分別收取12、24、36、48、72、96、120 h的細(xì)胞培養(yǎng)物，測其TCID50， 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別做3次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值。7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的TCID50平均值分別為10-2.49、10-3.5、10-6.84、10-8.9、10-7.86、10-5.38、10-3.64，繪制出生長曲線(圖3)。該曲線顯示，ARV接種DF1細(xì)胞后，0～12 h為靜止期，12 h～48 h為快速增長期，在48 h達(dá)到最大的病毒效價(jià)，TCID50為10-8.9/0.1 mL。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000;1.PCR Product；2.Negative control

圖2 ARV RT-PCR檢測結(jié)果

Fig.2 Detection results of ARV by RT-PCR

圖3 ARV S1133在DF1細(xì)胞上的生長曲線

3 討論

隨著養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展，禽病發(fā)生日益增多。近年來，多省份陸續(xù)有ARV感染疫情的發(fā)生，報(bào)道指出ARV有更廣的宿主范圍，更強(qiáng)的致病性，流行的疫區(qū)也日漸擴(kuò)大，是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病[10]。目前，分離ARV一般采用雞胚接種，此法雖然單次獲毒較多，但需要的時(shí)間長，且操作繁瑣，在快速獲取大量病毒方面不具有時(shí)效性，在一定程度上反而限制了ARV的分離[11]。DF1細(xì)胞系來源于ELL雞胚胎，該細(xì)胞無禽白血病病毒、肉瘤病毒內(nèi)源性基因，同時(shí)在形態(tài)上呈纖維狀，是一種穩(wěn)定的、無腫瘤基因、自發(fā)無限增殖的細(xì)胞系。目前被廣泛用于動物病毒研究、疫苗研制、癌癥研究等諸多領(lǐng)域，是生命科學(xué)領(lǐng)域重要的病毒轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)生物材料。ARV基因組為RNA，而DF1細(xì)胞可用于反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制，DF1細(xì)胞系有助于ARV對細(xì)胞殺傷力的研究。為此，采用了細(xì)胞增殖病毒的方法，研究了ARV S1133毒株在DF1細(xì)胞上的增殖特性 ，大大縮短了獲取大量病毒的時(shí)間，大幅提高了獲毒效率。

定量描述病毒生長規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線稱為一步生長曲線，根據(jù)病毒的生長特點(diǎn)可劃分為靜止期、快速增長期、穩(wěn)定期3個(gè)時(shí)期[12]。通常用來研究病毒在細(xì)胞上的增殖規(guī)律的方法主要有測定病毒的TCID50和病毒蝕斑試驗(yàn)[13-14]。本研究直接采取了測定病毒TCID50的方法，并用PCR檢測、測序確定細(xì)胞僅有ARV感染，無其他病原污染。試驗(yàn)結(jié)果顯示，ARV接種DF1細(xì)胞后，前24 h為靜止期，24 h后進(jìn)入快速增長期，并在48 h達(dá)到最大的病毒效價(jià)，即TCID50為10-8.9/0.1 mL。這一增殖規(guī)律可能與細(xì)胞的自身免疫機(jī)制有關(guān)，至于真正的原因，還待進(jìn)一步的研究。本研究結(jié)果表明，ARV可在DF1細(xì)胞上有效地增殖，并伴有典型病變，在接毒48 h后出現(xiàn)病毒效價(jià)峰值，TCID50為10-8.9/0.1 mL。ARV感染DF1細(xì)胞的最佳收毒時(shí)間為接毒后的48 h。本研究結(jié)果可為下一步用DF1細(xì)胞研制ARV滅活苗及致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)[15]。

[1] Saif Y M.禽病學(xué)[M].12版.高 福,索 勛,譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2012:355-379.

[2] 張昆麗,謝芝勛,黃 莉,等.禽呼腸病毒感染對SPF雞外周血T細(xì)胞亞型變化和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的影響[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(1):1-4.

[3] Javier B,Jose M C.Avian reovirus:structure and biology[J].Virus Res,2006,123(2):105-119.

[4] Jones R C.Avian reovirus infection[J].Revue Scientifique Et Technique,2000,19(2):614-625.

[5] 謝麗基.禽呼腸孤病毒σ3基因的真核表達(dá)及σNS基因的原核表達(dá)與序列分析[D].廣西南寧：廣西大學(xué),2006.

[6] Hedayati M,Shojadoost B,Peighambari S M.Detection of avian reoviruses causing tenosynovitis in breeder flocks in Iran by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and restriction enzyme fragment length polymorphism (RFLP)[J].Acta Paediatrica,2013,50(4):385-386.

[7] 丁明洋,畢莊莉,朱英奇,等.新型鴨呼腸孤病毒TH11株在BHK21細(xì)胞系中的增殖特性[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2015,45(9):918-922.

[8] 黃 莉,謝芝勛,謝麗基,等.禽呼腸孤病毒強(qiáng)毒株和弱毒疫苗株感染Vero細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2016,47(2):331-339.

[9] 余愛花.3株鴨源呼腸孤病毒對鴨胚成纖維細(xì)胞致病性研究[D].湖北武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[10] 陳少鶯,陳仕龍,林鋒強(qiáng),等.新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J].病毒學(xué)報(bào),2012,28(3):224-230.

[11] Heffels-Redmann U,Muller H,Kaleta E F.Structural and biological characteristics of reoviruses isolated from Muscovy ducks (Cairinamoschata)[J].Avian Pathol,1992,21(3):481-491.

[12] 韓 燕,朱 玲,周遠(yuǎn)成,等.犬細(xì)小病毒四川株的分離鑒定與一步生長曲線的測定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014,34(3):379-383.

[13] 代洪波,陳 蕾,朱 玲,等.豬傳染性胃腸炎病毒四川株的分離鑒定與一步生長曲線的測定[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2012,42(12):1224-1229.

[14] 付玉志,張洪輝,李傳峰,等.Ⅰ型鴨肝炎病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞系中的增殖特性研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,35(2):110-113.

[15] 孫永珍.傳染性喉氣管炎病毒LJS09株在LMH細(xì)胞上的生長特性研究及糖蛋白gG、gC的抗體制備[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2014.