劉 月，宋 迪，崔鈺晗，王 潔

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

反轉(zhuǎn)錄病毒感染過程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)是DNA反轉(zhuǎn)中間體的產(chǎn)生并整合入宿主細(xì)胞的染色體中，而DNA反轉(zhuǎn)中間體可以被細(xì)胞內(nèi)DNA識(shí)別受體所識(shí)別，從而誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)的產(chǎn)生以及其他抗病毒應(yīng)答反應(yīng)，達(dá)到抑制病毒復(fù)制并最終清除病毒的目的。本文主要綜述反轉(zhuǎn)錄病毒感染過程中細(xì)胞內(nèi)DNA識(shí)別受體對(duì)反轉(zhuǎn)錄病毒感染的影響。

1 固有免疫應(yīng)答反應(yīng)

固有免疫對(duì)入侵病原體的識(shí)別和調(diào)控是近年來免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。固有免疫系統(tǒng)主要通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)來識(shí)別各種病原體[1]。機(jī)體內(nèi)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)6種PRR家族：Toll樣受體家族、核苷酸寡聚結(jié)合域(nucleotide binding oligomerization domain,NOD)樣受體家族、細(xì)胞內(nèi)RNA識(shí)別受體家族、細(xì)胞內(nèi)DNA識(shí)別受體家族、C類凝集素受體家族及其他固有免疫特異性PRR[2]。這些PRR有些存在于細(xì)胞表面，有些存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，通過與選擇性或特定性的信號(hào)分子結(jié)合而激活不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同病原體的固有免疫調(diào)控。

目前，DNA引起固有免疫反應(yīng)的具體機(jī)制尚未完全清楚。近年來，病毒DNA識(shí)別受體的鑒定和機(jī)制研究取得了一些突破性的進(jìn)展[3]，然而對(duì)于反轉(zhuǎn)錄病毒與固有免疫反應(yīng)的相互作用和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究還略顯滯后。研究顯示，反轉(zhuǎn)錄病毒可以通過各種PRR選擇性地引發(fā)一系列固有免疫反應(yīng)。某些細(xì)胞內(nèi)DNA識(shí)別受體可以檢測到反轉(zhuǎn)錄病毒的入侵，如環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS)、γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16(gamma-interferon-inducible protein 16，IFI16)及Ku70等DNA識(shí)別受體在反轉(zhuǎn)錄病毒感染期間可以誘導(dǎo)IFN抗病毒免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，在某些細(xì)胞中還能夠觸發(fā)細(xì)胞凋亡機(jī)制，使反轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步抑制反轉(zhuǎn)錄病毒感染[4]。

2 反轉(zhuǎn)錄病毒感染

反轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒的一種，其遺傳信息主要儲(chǔ)存在RNA上。反轉(zhuǎn)錄病毒感染時(shí)，首先在其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA，新合成的cDNA插入宿主的核DNA中，隨宿主DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯而擴(kuò)增，可表現(xiàn)為人和多種動(dòng)物的惡性腫瘤和免疫缺陷病[5]。由此可見，反轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的反轉(zhuǎn)錄病毒DNA中間體對(duì)反轉(zhuǎn)錄病毒感染的初始識(shí)別至關(guān)重要。

反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制包括幾個(gè)不同的階段。反轉(zhuǎn)錄病毒感染的第1步涉及病毒包膜糖蛋白與宿主細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體之間的特異性相互作用。病毒包膜與靶細(xì)胞膜的相互作用使病毒侵入細(xì)胞，病毒完成脫包膜并把病毒核心顆粒釋放到細(xì)胞質(zhì)中[6]。病毒DNA合成是反轉(zhuǎn)錄病毒感染的核心過程，一般在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中開始。在反轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中，病毒單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)通過反轉(zhuǎn)錄酶作用，產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄病毒雙鏈DNA(double stranded DNA，dsDNA)[7]。反轉(zhuǎn)錄過程中的酶促反應(yīng)是由反轉(zhuǎn)錄酶的2種不同的酶活性促進(jìn)：(1)通過將合適的脫氧核糖核苷酸三磷酸摻入RNA或DNA模板中來延長引物的DNA聚合酶；(2)特異性降解RNA/DNA雜合體的RNA鏈的核糖核酸酶H活性。在細(xì)胞質(zhì)中合成后，病毒反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物遷移至細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)作為前病毒模板整合到細(xì)胞基因組中[8-9]。通過從人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV-1)感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分離復(fù)制核蛋白復(fù)合物顯示，復(fù)合物含有線性病毒DNA和整合酶，后者則是唯一能檢測到的蛋白，這些觀察表明整合酶是HIV-1整合前復(fù)合物的組成部分，且整合酶可能是整合反轉(zhuǎn)錄病毒DNA所需的唯一病毒蛋白[10]。

3 反轉(zhuǎn)錄病毒與DNA識(shí)別受體

固有免疫系統(tǒng)主要通過識(shí)別病毒核酸來感知病毒。一般有2種感知病毒核酸的模式[11]：(1)直接識(shí)別進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的反轉(zhuǎn)錄病毒的ssRNA，如Toll樣受體7/8可以直接識(shí)別反轉(zhuǎn)錄病毒的ssRNA；(2)識(shí)別病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的DNA中間體。因此，被感染的細(xì)胞可以通過細(xì)胞質(zhì)中存在的PRR來識(shí)別病毒復(fù)制時(shí)產(chǎn)生的病毒核酸，包括RNA識(shí)別受體[12]和DNA識(shí)別受體[13-15]。PRR的參與導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子和Ⅰ型IFN轉(zhuǎn)錄激活。Ⅰ型IFN和相鄰細(xì)胞上的Ⅰ型IFN受體結(jié)合，通過信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)IFN刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)的表達(dá)，從而阻斷病毒復(fù)制和傳播[14-15]。

3.1cGAS識(shí)別受體研究顯示，用細(xì)胞溶質(zhì)病毒DNA刺激細(xì)胞，通過cGAS促使環(huán)磷腺苷合成新型的第二信使環(huán)鳥苷酸-腺苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP)，cGAMP通過結(jié)合和激活干擾素相關(guān)基因刺激因子(stimulator of IFN genes，STING)的方式刺激Ⅰ型IFN產(chǎn)生[16-17]。cGAS缺失可以抑制反轉(zhuǎn)錄病毒感染引發(fā)的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此，cGAS是反轉(zhuǎn)錄病毒的關(guān)鍵識(shí)別受體[18]。HIV-1、鼠白血病病毒(murine leukemia virus，MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)以及人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型(human T lymphotropic virus typeⅠ，HTLV-1)等反轉(zhuǎn)錄病毒均可激活cGAS產(chǎn)生cGAMP，隨后結(jié)合并激活STING和Ⅰ型IFN應(yīng)答。通過敲除小鼠或人細(xì)胞系中的cGAS可阻斷HIV、MLV和SIV感染所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生。另外，針對(duì)HIV反轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑可以阻斷HIV病毒感染誘導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生，這表明HIV病毒反轉(zhuǎn)錄出的DNA對(duì)觸發(fā)固有免疫反應(yīng)非常關(guān)鍵。研究表明，將HeLa細(xì)胞與MT2細(xì)胞(HTLV-1陽性T細(xì)胞系)共培養(yǎng)后，HeLa細(xì)胞中cGAS表達(dá)升高，而在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)cGAS后，干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)和p65的磷酸化水平升高，IFN-β、腫瘤壞死因子-α表達(dá)增加，HTLV-1病毒蛋白表達(dá)下降。這些結(jié)果表明cGAS在HTLV-1感染的HeLa細(xì)胞中可能具有促進(jìn)固有免疫應(yīng)答并抑制HTLV-1病毒復(fù)制的功能[19]，cGAS是HIV和其他反轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞內(nèi)識(shí)別受體。

3.2γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白16(γ-interferon-inducibleprotein16，IFI16) IFI16是一種DNA識(shí)別受體，屬于PYHIN家族成員，包含2個(gè)能夠結(jié)合DNA的HIN結(jié)構(gòu)域。研究證明，IFI16在識(shí)別HIV-1來源的dsDNA中具有重要功能[20]。HIV-1的dsDNA、ssDNA固有免疫應(yīng)答反應(yīng)的誘導(dǎo)依賴于DNA結(jié)構(gòu)中的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而不是DNA序列，而這種應(yīng)答反應(yīng)依賴于IFI16對(duì)DNA的識(shí)別以及與STING的共定位[21]。將dsDNA或ssDNA轉(zhuǎn)染入原代人巨噬細(xì)胞可以激活I(lǐng)FI16-STING-TBK1-IRF3/7途徑，沉默巨噬細(xì)胞中的IFI16以后，HIV-1感染誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ⅰ型IFN水平明顯降低，說明IFI16可以識(shí)別HIV-1復(fù)制周期中產(chǎn)生的DNA序列，通過調(diào)節(jié)干擾素的產(chǎn)生來影響巨噬細(xì)胞中的HIV-1復(fù)制[22]。此外，反轉(zhuǎn)錄酶活性抑制劑齊多夫定也可以降低IFN應(yīng)答，表明IFI16識(shí)別的是反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)中間體。也有研究表明，小鼠IFI203、IFI204基因是IFI16的同源蛋白，含有2個(gè)C-末端Hind結(jié)構(gòu)域，敲除這2個(gè)分子以后可明顯抑制細(xì)胞對(duì)DNA的免疫應(yīng)答反應(yīng)[23]。STAVROU等[24]研究表明，MLV感染誘導(dǎo)快速 IFN-β 應(yīng)答，用特異的siRNA處理NR-9456細(xì)胞 24 h，并與缺乏病毒糖基化Gag蛋白表達(dá)的MLV變體溫育2 h，發(fā)現(xiàn) IFI203、cGAS和STING沉默均可降低病毒感染后24 h的IFN-β應(yīng)答；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞后，IFI203由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，直接與病毒DNA相互作用，啟動(dòng)抗病毒反應(yīng)。

3.3Ku70識(shí)別受體ZHANG等[25]首次證明Ku70是一種新型的細(xì)胞內(nèi)DNA識(shí)別受體，在人胚腎293細(xì)胞中，Ku70主要借助IRF1和IRF7來誘導(dǎo)Ⅲ型IFN的產(chǎn)生，對(duì)Ⅰ型IFN的產(chǎn)生無明顯影響。但也有研究表明，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，Ku70通過STING-TBK1-IRF3信號(hào)途徑對(duì)痘病毒、改良型痘苗病毒安卡拉株和1型單純皰疹病毒等多種DNA病毒進(jìn)行響應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFN[26]。研究表明，HTLV-1感染可誘導(dǎo)Ku70高表達(dá)，Ku70過表達(dá)可抑制HTLV-1蛋白表達(dá)，而Ku70沉默促進(jìn)了HTLV-1蛋白表達(dá)；另外，Ku70與HTLV-1的DNA反轉(zhuǎn)中間體ssDNA90存在相互作用，ssDNA90刺激能夠誘導(dǎo)Ku70表達(dá)，且Ku70可以促進(jìn)ssDNA90觸發(fā)的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，HTLV-1感染增強(qiáng)了Ku70與STING的結(jié)合，STING在Ku70介導(dǎo)的抗HTLV-1感染的宿主防御中非常關(guān)鍵[27]。

3.4DExD/H盒解螺旋酶41(DExD/H-boxhelicase41，DDX41) DEXDc解旋酶家族成員DDX41是髓系來源的樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells，mDC)中的細(xì)胞內(nèi)DNA識(shí)別受體。研究表明，利用shRNA沉默DDX41后可以顯著抑制mDC對(duì)DNA和DNA病毒的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)；DDX41和STING過表達(dá)在促進(jìn)IFN-β啟動(dòng)子活性方面具有協(xié)同效應(yīng)，DDX41結(jié)合DNA和STING并與STING在細(xì)胞質(zhì)中一起定位，沉默DDX41表達(dá)則能阻斷B型DNA激活TBK1、核因子κB和IRF3[28]。LEE等[29]研究表明，Bruton酪氨酸蛋白激酶(Bruton tyrosine kinases，BTK)與STING和DDX41相互作用，BTK磷酸化DDX41，BTK在激活DDX41和STING信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。STAVROU等[30]研究證明，DDX41可識(shí)別MLV病毒核酸，激活STING信號(hào)，導(dǎo)致IRF3生產(chǎn)增加，誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生。

3.5STINGSTING在固有免疫中發(fā)揮著重要作用，幾乎所有的DNA受體均要通過STING蛋白將信號(hào)向下游傳遞。同時(shí)，STING也可直接或間接識(shí)別DNA。SZE等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在HTLV-1刺激的單核細(xì)胞中，磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活轉(zhuǎn)錄因子1、磷酸化IRF3、ISG56表達(dá)增強(qiáng)，而用siRNA沉默STING后，磷酸化IRF3、ISG56以及Bax表達(dá)明顯下降；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，STING與HTLV-1的反轉(zhuǎn)中間體ssDNA90或dsDNA90在原代培養(yǎng)的單核細(xì)胞中有直接的相互作用；這說明STING通過識(shí)別反轉(zhuǎn)錄病毒的反轉(zhuǎn)中間體而激活I(lǐng)RF3，從而誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的免疫應(yīng)答反應(yīng)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染了ss/dsDNA90的細(xì)胞中，STING可以促進(jìn)IRF3-Bax凋亡復(fù)合物的形成，從而誘導(dǎo)線粒體依賴性細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)束語

細(xì)胞對(duì)反轉(zhuǎn)錄病毒的抗病毒固有免疫應(yīng)答反應(yīng)仍有很大的研究空間，例如，DNA識(shí)別受體是否可以區(qū)分不同的反轉(zhuǎn)中間體，不同DNA識(shí)別受體對(duì)病原體識(shí)別的相對(duì)貢獻(xiàn)如何，它們之間是否存在協(xié)同作用等。值得注意的是，敲除這些DNA識(shí)別受體中的任何一個(gè)均會(huì)影響Ⅰ型IFN產(chǎn)生，表明這些DNA識(shí)別受體在反轉(zhuǎn)錄病毒感染誘發(fā)的抗病毒固有免疫信號(hào)傳導(dǎo)中均具有重要作用。敲除IFI16、cGAS或STING均可以增加人單核細(xì)胞中HIV-1的復(fù)制，表明這些DNA識(shí)別受體在控制髓系來源細(xì)胞中HIV復(fù)制方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[32]。由于IFI16、cGAS、Ku70及DDX41這些DNA識(shí)別受體均使用接頭蛋白STING，它們介導(dǎo)的DNA識(shí)別與下游信號(hào)通路之間可能存在交叉反應(yīng)。這些識(shí)別受體在不同的反轉(zhuǎn)錄病毒感染不同的細(xì)胞中的功能仍有待進(jìn)一步研究?？共《竟逃忻庖邞?yīng)答反應(yīng)對(duì)即時(shí)抑制反轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制和擴(kuò)散至關(guān)重要，而適應(yīng)性免疫應(yīng)答對(duì)消除病毒感染和長期免疫記憶至關(guān)重要。了解反轉(zhuǎn)錄病毒感染與DNA識(shí)別受體的關(guān)系，有利于感染者在病毒感染初期做出有效的應(yīng)對(duì)措施。有研究表明，IFI16不僅通過STING誘導(dǎo)Ⅰ型IFN應(yīng)答反應(yīng)，還誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞中分泌白細(xì)胞介素-1β[33]。該項(xiàng)研究不僅揭示了IFI16在感知HIV-1復(fù)制中間體中的新作用，還強(qiáng)調(diào)了通過相同識(shí)別受體在不同細(xì)胞類型中激活下游的抗病毒和細(xì)胞死亡途徑的差異。將先天性免疫與適應(yīng)性免疫結(jié)合，詳細(xì)了解人體免疫機(jī)制可能有助于發(fā)現(xiàn)精確治療靶點(diǎn)，對(duì)新型治療藥物的研發(fā)、阻斷反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制、誘導(dǎo)感染細(xì)胞凋亡或死亡有重要意義。