[湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院（湖南省人民醫(yī)院） 關(guān)節(jié)與運動醫(yī)學(xué)科，湖南 長沙 410000]

半月板是一種纖維軟骨結(jié)構(gòu)，在關(guān)節(jié)內(nèi)傳遞負(fù)荷、營養(yǎng)軟骨及減少摩擦等，其損傷后導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)異常負(fù)荷及炎癥的產(chǎn)生，繼發(fā)軟骨的退變，加速骨關(guān)節(jié)炎的進展[1]，成為了運動醫(yī)學(xué)中的難題。早期的治療如半月板切除術(shù)，雖能在一定程度上緩解癥狀，但導(dǎo)致軟骨的 接觸應(yīng)力大幅度增加。隨著微創(chuàng)技術(shù)的發(fā)展，關(guān)節(jié)鏡下修復(fù)半月板損傷是目前最佳的手術(shù)方式。然而，由于半月板最常見的損傷區(qū)域（白區(qū)）的無脈管系統(tǒng)分布，常導(dǎo)致術(shù) 后恢復(fù)受限[2]。因此，在行手術(shù)時，使用其他方法促進半月板修復(fù)成為了熱點[3]。目前臨床上的方法如纖維蛋白凝塊技術(shù)[4]、滑膜移植[5-6]、藥物[7]及生長因子[8]等，效果有限，且手術(shù)難度和費用較高。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchyma stem cell，MSC）得到了廣泛的研究[9]，并視其為修復(fù)半月板損傷的最佳種子細(xì)胞[10]。MSC可體外復(fù)合天然生物或高分子合成支架，構(gòu)建半月板再生結(jié)構(gòu)組織[11-12]；缺損處自體MSC聚集組裝移植與關(guān)節(jié)腔內(nèi)MSC注射能促進半月板再生等[13-15]。因此，圍手術(shù)期中利用干細(xì)胞的多分化潛能成為了焦點[16]，但現(xiàn)有的MSC治療方法存在周期長、細(xì)胞來源少、支架力學(xué)性能及生物活性差和二次手術(shù)的可能等問題[17]，導(dǎo)致其在臨床上使 用受到限制。從解剖中，本團隊發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)毗鄰股骨髓腔，其內(nèi)有髕下脂肪墊，若通過在關(guān)節(jié)鏡下手術(shù)處理，釋放骨髓及脂肪來源 的干細(xì)胞，可減少操作流程，有望加快和簡化修復(fù)半月板損傷的進程。本研究希望通過基礎(chǔ)實驗及臨床研究，分析關(guān)節(jié)鏡下髁間窩微骨折術(shù)與髕下脂肪墊粉碎術(shù)對半月板損傷修復(fù)的作用機制及其療效。

1 資料與方法

1.1 試劑與材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、甘氨酸購自Sigma公司；紅細(xì)胞裂解液、磷酸緩沖鹽溶液（ p hosphate buffer saline，PBS）購自Beyotime公司；Human MSC Analysis Kit購自BD StemflowTM；二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)箱購自Thermo Forma公司；倒置顯微鏡、光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus公司；臺式冷凍離心機購自Thermo Scientific公司。

1.2 髁間窩微骨折術(shù)

于股骨髁間窩內(nèi)行微骨折術(shù)，吸引器將孔洞流出的骨髓液吸入離心管，轉(zhuǎn)運至實驗室。500 g離心5 min，棄上清，紅細(xì)胞裂解液重懸，避光裂解2 min，500 g離心5 min，棄上清，PBS重懸，500 g離心5 min，棄上清，加入10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，于37℃+5% CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，每隔2 d換液，細(xì)胞匯合度達到80% 以上時傳代，對第1代實驗細(xì)胞進行鏡下觀察，用人間充質(zhì)干細(xì)胞試劑盒對其進行鑒定。

1.3 髕下脂肪墊粉碎術(shù)

在股骨髁間窩前方髕下脂肪墊處，刨削刀將一小塊脂肪墊打碎成1.0 mm×1.0 mm大小，吸引器將脂肪小塊連同周圍的液體吸入離心管，轉(zhuǎn)運至實驗室。PBS反復(fù)清洗，100μm及40μm濾網(wǎng)過濾，400 g離心5 min，棄上清，紅細(xì)胞裂解液重懸，避光裂解10 min，400 g離心5 min，加入10% FBS的DMEM/ F12培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，于37℃+5% CO2孵箱中培養(yǎng)，48 h后首次換液，每隔2 d換液，細(xì)胞匯合度達到80%以上時傳代，對第1代實驗細(xì)胞進行鏡下觀察，用人間充質(zhì)干細(xì)胞試劑盒對其進行鑒定。

1.4 一般資料

回顧性分析2014年1月-2016年1月診療的單側(cè)單純半月板損傷并行手術(shù)的患者，共計75例（75膝），病例均來自本院同一治療組的住院患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～35歲，無嚴(yán)重肝、腎、心及造血系統(tǒng)疾病等；既往無膝關(guān)節(jié)手術(shù)史；符合下述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有韌帶損傷、髕骨軟骨軟化、軟骨損傷、游離體及滑膜皺襞綜合征等其他關(guān)節(jié)紊亂疾??；精神狀態(tài)欠佳或不配合者；既往有膝關(guān)節(jié)手術(shù)史；患有嚴(yán)重肝、腎、心及造血系統(tǒng)疾病等；骨腫瘤；未簽知情同意書者。按照關(guān)節(jié)鏡中手術(shù)處理方式不同，將75例患者分為髁間窩微骨折術(shù)組（A組25例）、髕下脂肪墊粉碎術(shù)組（B組25例）及對照組（C組25例）。3組患者的年齡、體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）、半月板損傷類型及性別構(gòu)成比等方面分布相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 各組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general data among the three groups

1.5 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 癥狀急性受傷時膝關(guān)節(jié)內(nèi)可有撕裂聲；上下樓時有打軟腿及錯動感；患肢有乏力不穩(wěn)感；運動能力明顯下降。

1.5.2 體征急性期間可有關(guān)節(jié)腫脹；關(guān)節(jié)間隙壓痛；McMurry（+），Apley（+）；過伸、過屈（+）。

1.5.3 檢驗結(jié)果急性損傷可有紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）及白細(xì)胞數(shù)目增多；陳舊性損傷中血生化檢查一般無明顯異常。

1.5.4 影像學(xué)檢查X片及CT一般無明顯異常，偶見關(guān)節(jié)間隙增寬；磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）提示半月板損傷（多為Ⅲ度信號，通向上下關(guān)節(jié)腔表面）影像。

1.6 治療方法

A組：在行半月板成型縫合術(shù)后，用微骨折器械，于髁間窩處鉆出小孔，使一部分骨髓和血液從孔中滲出。B組：在行半月板成型縫合術(shù)后，在髁間窩前方髕下脂肪墊處，用刨削刀將一小塊脂肪墊（約0.5 cm×0.5 cm）充分反復(fù)打碎，成1.0 mm×1.0 mm大小。C組：空白對照組，行常規(guī)的半月板縫合術(shù)后，并未進行其他特殊處理。

常規(guī)手術(shù)方式：麻醉滿意后，患者取仰臥位，取常規(guī)膝前內(nèi)外側(cè)入路長約0.5 cm，置入關(guān)節(jié)鏡，探查可見半月板損傷，清理半月板白區(qū)撕裂組織，紅白區(qū)采用Fast-fix進行縫合，修整半月板邊緣，注入玻璃酸鈉，彈力繃帶加壓包扎。術(shù)中具體過程見圖1。

1.7 治療后隨訪及療效評估

所有患者手術(shù)前及隨訪時均采用Lysholm、視覺模擬評分法（visual analogue scale，VAS）評分 及不良事件（關(guān)節(jié)腫脹及膝前區(qū)疼痛）評估。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。檢驗數(shù)據(jù)差值是否符合正態(tài)分布和滿足組間方差齊性，如果滿足，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用單因素方差分析與配對t檢驗；若不滿足，采用秩和檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 術(shù)中具體過程Fig.1 Intraoperative specific process

圖2 髁間窩微骨折體外細(xì)胞培養(yǎng)鏡下圖片F(xiàn)ig.2 Micrograph of cells released by fossa intercondyloidea of micro-fracture

2 結(jié)果

2.1 體外基礎(chǔ)實驗

2.1.1 髁間窩微骨折術(shù)體外實驗在體外培養(yǎng)8～10 d后可見培養(yǎng)瓶中細(xì)胞類似 成纖維細(xì)胞，生長迅速，長梭狀，呈旋渦狀分布，細(xì)胞界限清楚，排列緊密，密度較高，具有干細(xì)胞的特性，見圖2。將第1代細(xì)胞用人干細(xì)胞分析試劑盒進行鑒定，可見樣本細(xì)胞表面CD90、CD105、CD73及CD44表達比例高（＞95%），符合干細(xì)胞的定義標(biāo)準(zhǔn)，考慮其為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）[18]，見圖3。

圖3 髁間窩微骨折體外細(xì)胞干細(xì)胞試劑盒鑒定結(jié)果Fig.3 Human MSC Analysis Kit results of cells released by fossa intercondyloidea of micro-fracture

2.1.2 髕下脂肪墊粉 碎術(shù)體外實驗在體外培養(yǎng)8～10 d后可見培養(yǎng)瓶中絕大多 數(shù)細(xì)胞類似成纖維細(xì)胞，含有少量雜質(zhì)及壞死細(xì)胞，呈長梭狀，呈平行排列，網(wǎng)狀輻射狀生長，細(xì)胞界限清楚，排列規(guī)則，具有干細(xì)胞的特征，見圖4。將第1代細(xì)胞用人干細(xì)胞分析試劑盒進行鑒定，可見樣本細(xì)胞表面CD90、CD105及CD73表達比例高（＞95%），CD44相對較少，符合干細(xì)胞的定義標(biāo)準(zhǔn)，考慮其為髕下脂肪墊來源干細(xì)胞（infrapatellar fat pad-derived stem cells，IPFPSCs）[18]，見圖5。

圖4 髕下脂肪墊粉碎體外細(xì)胞鏡下圖片F(xiàn)ig.4 Micrograph of cells released by comminution of subcutaneous fat pad

2.2 臨床研究

所有患者均獲平均10個月（8～11個月）隨訪，無神經(jīng)血管損傷、感染等并發(fā)癥。術(shù)前，A、B、C組的Lysholm及VAS評分的組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），不良事件大致相同。術(shù)后末次隨訪中，各組末次隨訪的結(jié)果較治療前均有明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組與C組、B組與C組間的Lysholm及VAS評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A組與B組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。B組的不良事件早期發(fā)生率高于A組及C組，末次隨訪時無明顯差異，見表3。半月板損傷修復(fù)術(shù)后情況見圖6。

圖5 髕下脂肪墊粉碎體外細(xì)胞干細(xì)胞試劑盒鑒定結(jié)果Fig.5 Human MSC Analysis Kit results of cells released by comminution of subcutaneous fat pad

表2 各組治療前后Lysholm和VAS評分比較 （分，±s）Table 2 Comparison of Lysholm and VAS score among the three groups （score，±s）

表2 各組治療前后Lysholm和VAS評分比較 （分，±s）Table 2 Comparison of Lysholm and VAS score among the three groups （score，±s）

注：1）A組與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；2）B組與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）

t值 P值治療前 末次隨訪 治療前 末次隨訪A組（n =25） 55.16±5.09 90.16±2.801） 30.15 0.001 2.24±0.93 0.64±0.571） 7.37 0.001 B組（n =25） 54.96±5.22 90.92±2.342） 31.44 0.0 01 2.12±1.01 0.68±0.632） 6.04 0.001 C組（n =25） 54.16±4.88 87.20±3.07 28.66 0.001 2.24±1.05 1.08±0.57 4.85 0.001 F值 0.273 12.75 0.12 4.26 P值 0.792 0.001 0.887 0.018 Lysholm評分VAS評分組別t值 P值

表3 各組治療前后不良事件發(fā)生例數(shù)比較 例Table 3 Comparison of adverse event rate among the three groups n

圖6 半月板損傷修復(fù)術(shù)后Fig.6 Repaired meniscus injury

3 討論

半月板損傷后增加關(guān)節(jié)內(nèi)接觸壓力，導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙[19]。近年來，隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的深入，通過再生醫(yī)學(xué)修復(fù)損傷的半月板得到了關(guān)注[20-21]，并認(rèn)為最佳的修復(fù)方法通過下列途徑：①細(xì)胞通過黏附于機械支架并形成新的組織形態(tài)；②選擇合適的種子細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化，來促進組織的愈合及新基質(zhì)的合成；③添加某種生長因子或?qū)ふ夷艽碳ぜ?xì)胞分化及基因表達的信號[22-24]。

目前，研究者們希望使用MSCs治療半月板白區(qū)損傷。HORIE等[25]研究發(fā)現(xiàn)將滑膜干細(xì)胞移植黏附于半月板白區(qū)受損部位，最終可分化成類似于天然半月板成纖維軟骨的細(xì)胞；HATSUSHIKA等[26]通過組織學(xué)和MRI檢查發(fā)現(xiàn)滑膜干細(xì)胞使半月板缺損處滑膜早期填充，可有效保留更多的半月板；DUYGULU等[27]通過電鏡觀察到自體BMSCs可使半月板缺損處新生血管、纖維軟骨細(xì)胞及軟骨斑塊增多。因此，MSC被認(rèn)為是修復(fù)半月板損傷的最佳種子細(xì)胞[28]。

臨床中常用微骨折術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷，其機制是利用從骨髓腔流出的BMSC填充于缺損處，利用其多分化功能，最終可形成纖維軟骨[29]。由此，本研究設(shè)想其是否同樣可以利用來修復(fù)半月板損傷。相比常規(guī)在軟骨上的微骨折術(shù)，選擇髁間窩處微骨折，在釋放干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，可避免造成新的軟骨損傷、能減少疼痛的發(fā)生率及康復(fù)難度。基礎(chǔ)實驗可證實術(shù)中釋放的骨髓液中含有BMSC；臨床隨訪可見Lysholm評分及VAS評分較對照組改善。因此，髁間窩微骨折術(shù)從理論、基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用中證實其對半月板損傷修復(fù)有良好的效果，這與HOWARTH等研究是相同的[30]。

半月板損傷后，髕下脂肪墊常發(fā)生水腫，導(dǎo)致膝前區(qū)疼痛。在術(shù)中，脂肪墊需修整，減少其病理炎癥的發(fā)展。研究表明：髕下脂肪墊靠近滑膜面，所處環(huán)境與關(guān)節(jié)腔類似，具有同源性[31]，其干細(xì)胞為脂肪來源，具有多分化能力[32-33]。由此，本研究探索性地提出了髕下脂肪墊粉碎術(shù)，在緩解病理炎癥的基礎(chǔ)上，釋放脂肪干細(xì)胞至關(guān)節(jié)內(nèi)?；A(chǔ)實驗表明粉碎后的脂肪墊懸液中含有IPFPSC。臨床隨訪提示該技術(shù)的術(shù)后評分優(yōu)于對照組，與髁間窩微骨折術(shù)的效果相當(dāng)，這與NISHIMUTA及HINDLE等研究較為相似[32-34]。然而，本研究中發(fā)現(xiàn)，髕下脂肪墊粉碎術(shù)的早期不良事件發(fā)生率較高，遠(yuǎn)期則無明顯差異，可能與脂肪墊的出血及無菌炎癥反應(yīng)增加有關(guān)[35]。綜上所述，關(guān)節(jié)下髁間窩微骨折術(shù)與髕下脂肪墊粉碎術(shù)能在一定程度上促進半月板損傷的修復(fù)，并具有獨特的優(yōu)勢。至于其具體的詳細(xì)作用機制及修復(fù)的遠(yuǎn)期效果，還有待進一步研究。

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