楊豆　張衛(wèi)波　樊華

摘要：為了合理利用絞股藍資源，對采摘末期絞股藍中的黃酮進行微波輔助提取，選擇微波功率、微波溫度、微波時間、料液比、乙醇體積分數(shù)為影響因子，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過正交實驗優(yōu)化了提取工藝，結(jié)果顯示，微波功率300W，微波時間10min，微波溫度70℃，料液比1：25g/mL，乙醇體積分數(shù)30%。此條件下黃酮的平均得率為4.898mg/g。采摘末期的絞股藍中富含植物黃酮?？蓪⑦@部分資源合理利用在飼料工業(yè)中來發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵字：微波輔助；提??；絞股藍；黃酮；優(yōu)化

前言

絞股藍為葫蘆絞股藍屬多年生草質(zhì)藤本植物，又叫七葉草，因為生命力旺盛，容易栽培而俗稱遍地生根。絞股藍主要分布在陜西、四川、云南、湖南、湖北等地。秦巴山區(qū)盛產(chǎn)絞股藍，出口國外，因此被譽為“絞谷”。絞股藍具有很高的藥用價值。富含皂苷、氨基酸、微量元素、黃酮、萜類、有機酸、生物堿、多糖、蛋白質(zhì)等。其中的活性成分黃酮與動物的內(nèi)分泌、脂質(zhì)代謝及抗氧化有著密切的關(guān)系，在促進動物生產(chǎn)性能及提高免疫力等方面起著重要作用。黃酮是植物的次級代謝產(chǎn)物，含量會隨植物生長發(fā)生變化，為了合理利用采摘末期的絞股藍資源，實驗采用微波輔助提取技術(shù)分別對4～11月份的絞股藍中的黃酮進行提取并比較得率，重點對采摘末期11月份的絞股藍中的黃酮提取工藝進行優(yōu)化研究，以期為其在飼料工業(yè)中的合理應(yīng)用提供理論參考。

1實驗

1.1實驗材料及儀器

絞股藍購于陜西平利農(nóng)貿(mào)市場，清洗除雜后干燥粉碎，過60目篩于陰涼干燥處放置備用：蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢驗所，純度≥99%）；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。

GR-200電子天平：日本AND；TU-1810紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；pHS-3TC（0.01級）精密酸度計：上海天達儀器有限公司：電熱鼓風(fēng)干燥箱101型：北京科偉永興儀器有限公司：DHG-9075A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司：WF-2000微波快速反應(yīng)系統(tǒng)：上海屹堯分析儀器有限公司：80-1型離心機：江蘇金壇正基儀器有限公司：FW117中草藥粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司。

1.2實驗

1.2.1蘆丁標準曲線的繪制

精確量取0.5g的蘆丁標準樣品，用體積分數(shù)為30%的乙醇溶解后轉(zhuǎn)入500mL的容量瓶中，配制1mg/mL的黃酮溶液，精密移取1mL放入100mL的容量瓶中用體積分數(shù)為30%的乙醇定容，配制10μg/mL的黃酮標準液。分別精密移取0，1，2，3，4，5，6mL放入7個50mL的容量瓶中，各加入1.0mL濃度為50g/L的NaNO₂溶液混勻，放置6min后加入1.0mL濃度為100g/L的Al（NO₃）3溶液混勻，放置6min。再加入10.0mL濃度為40g/L的NaOH溶液，最后用30%乙醇定容至刻度，再放置15min后于510.00nm波長處測其吸光度，并以其為縱坐標。黃酮待測液濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：y=0.1206x-0.0208，R²=0.9972，說明黃酮濃度在0～10μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2絞股藍中黃酮的提取

將備用的絞股藍粉末和乙醇水溶液按照一定的料液比配制好后移入微波反應(yīng)系統(tǒng)，設(shè)定微波功率、微波時間、微波溫度、料液比、乙醇體積分數(shù)進行微波提取。提取后所得的混合液經(jīng)過抽濾、離心得到上清液，按照1.2.1的方法測定吸光度。計算絞股藍中黃酮的得率。

1.2.3黃酮得率的計算

黃酮得率/（mg/g）=[（y+0.0208）v/0.1206]/m

式中：y—待測液吸光度；v—測定液的體積（mL）；m—每次提取時所用絞股藍質(zhì)量：

1.3正交實驗設(shè)計

選擇微波功率、微波時間、微波溫度、料液比、乙醇體積分數(shù)五個因素為正交實驗的考察因子，以絞股藍中黃酮得率為指標，采用五因素四水平的正交實驗設(shè)計優(yōu)化絞股藍中黃酮的提取，實驗安排見表1。

2實驗結(jié)果及討論

2.1不同月份絞股藍中黃酮的提取效果比較

采摘末期的絞股藍當作茶葉去加工經(jīng)濟價值較低，為了合理利用采摘末期的絞股藍資源，實驗探究了不同月份的絞股藍中黃酮得率的變化，分別設(shè)定設(shè)定微波功率300W，料液比1：20g/mL，微波溫度60℃，微波時間8min，乙醇體積分數(shù)30%進行微波提取，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著月份的變化，絞股藍中黃酮的微波提取得率也有很大差異，其中六月份的絞股藍中黃酮的得率最高。4～6月份大部分的絞股藍開始大量采摘，其中的黃酮含量也隨采摘月份增大。6月份的絞股藍中的黃酮含量最高。之后。絞股藍中黃酮含量逐漸減小。11月份屬于絞股藍的采摘末期，此時的絞股藍的經(jīng)濟價值遠不及4～8月份，但是其中的活性成分黃酮含量是6月份的80%左右，含量相對豐富。植物黃酮具有多種生物活性，在食品、化妝品、醫(yī)藥、畜牧等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，因此合理開發(fā)利用這部分資源具有現(xiàn)實意義重大。

2.2單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1微波功率的選擇

實驗過程中設(shè)定料液比1：20g/mL，微波溫度60℃。微波時間8min。乙醇體積分數(shù)30%?？疾煳⒉üβ史謩e為100W，200W，300W，400W，500W時對絞股藍中黃酮得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

微波功率是微波能的直接體現(xiàn)，微波功率越大。微波能越大。微波能會使提取原料在短時間內(nèi)升溫繼而破壞其細胞壁，促進黃酮的溶出及在提取劑中的擴散。微波功率越大破壁效果越好，但是過大的微波功率雖然在提取初期有利于黃酮的溶出，但是隨著提取時間的延長。局部過熱現(xiàn)象會破壞黃酮的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致得率降低。由圖2可知，在100～300W微波功率范圍內(nèi)，黃酮得率先增大后減小，300W時對應(yīng)的得率最大，因此選擇300W為較佳微波功率。endprint

2.2.2微波時間的選擇

實驗過程中設(shè)定料液比1：20g/mL，微波功率300W。微波溫度60℃，乙醇體積分數(shù)30%?？疾煳⒉〞r間分別為4min，6min，8min，10min。12min時對絞股藍中黃酮得率的影響，結(jié)果如圖3示。

黃酮的浸出是一個傳質(zhì)過程，在4～10min范圍內(nèi)，絞股藍中黃酮得率隨微波時間的延長不斷增大，10min時對應(yīng)的得率最大，微波時間再延長得率減小。合適的微波時間能使絞股藍達到活化狀態(tài)。增強絞股藍顆粒分子內(nèi)部的有效碰撞，促進黃酮的溶出。微波時間短，絞股藍中的黃酮的提取不完全。微波時間過長，一方面導(dǎo)致提取劑揮發(fā)。另一方面，提取到的黃酮在長時間的微波作用下，結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，得不償失，由圖3可知，微波10min較好。

2.2.3微波溫度的選擇

實驗過程中設(shè)定料液比1：20g/mL，微波功率300W，微波時間8min，乙醇體積分數(shù)30%，考察微波溫度分別為50℃，60℃，70℃，80℃，90℃時對絞股藍中黃酮得率的影響，結(jié)果如圖4示。

微波溫度是微波提取過程中的重要影響因素之一，是微波能轉(zhuǎn)化為熱能的體現(xiàn)，直接影響絞股藍中黃酮分子的熱運動。由圖4可知，微波溫度在50～70℃范圍內(nèi)，隨著微波溫度的升高，黃酮得率增大，70℃時提取效果最好，過高的微波溫度則易造成局部熱量聚集，高溫容易破壞黃酮結(jié)構(gòu)，因此得率下降，綜上，選擇70℃為較佳微波溫度。

2.2.4乙醇體積分數(shù)的選擇

實驗過程中設(shè)定料液比1：20g/mL，微波功率300W，微波時間8min，微波溫度60℃，考察乙醇體積分數(shù)分別為20%，30%，40%，50%，60%時對絞股藍中黃酮得率的影響，結(jié)果如圖5示。

黃酮類化合物為多羥基酚類，極性比乙醇強而比水弱，在選用不同體積分數(shù)的乙醇對絞股藍中的黃酮進行提取時，隨著乙醇體積分數(shù)的增加。絞股藍中黃酮的得率不斷增大，當乙醇的體積分數(shù)為40%時，得率最大。乙醇體積分數(shù)大于40%后，黃酮的得率降低，這可能是因為高濃度的乙醇水溶液在提取黃酮過程中，絞股藍中的其他醇溶性物質(zhì)也溶出。與黃酮相互競爭，導(dǎo)致得率降低。因此選擇體積分數(shù)為40%的乙醇作為提取劑較合適。

2.2.5料液比的選擇

實驗過程中乙醇體積分數(shù)30%，微波功率300W。微波時間8min。微波溫度60℃，考察料液比分別為1：10g/mL，1：15g/mL，1：20g/mL，1：25g/mL，1：30g/mL時對絞股藍中黃酮得率的影響，結(jié)果如圖6示。

料液比是提取過程中傳質(zhì)的主要影響因素，料液比小，傳質(zhì)速率小，因此黃酮得率低，料液比增大，絞股藍中的黃酮得率不斷增大，但是提取原料絞股藍中的黃酮的總量是不變的，當料液比增大到一定程度后，黃酮的得率變化幅度會越來越小。正如圖6中所示，絞股藍中黃酮得率在1：10～1：30g/mL范圍內(nèi)隨著料液比的增大而增大，當料液比大于1：25g/mL時得率變化幅度很小，兼顧得率和提取成本，選擇1：25g/mL為較佳料液比。

3正交實驗結(jié)果及分析

為了優(yōu)化微波輔助提取絞股藍中黃酮的工藝條件，以單因素實驗中的五個因素作為影響因子，黃酮得率為指標，通過L16（45）正交實驗確定最佳提取工藝參數(shù)，按照表1實驗設(shè)計進行實驗。實驗結(jié)果見表2。方差分析見表3。

微波提取絞股藍黃酮中，各因素對黃酮得率的影響順序通過表2中的極差R反應(yīng)出來，因素對應(yīng)的R值越大。說明影響越大。通過比較可知，各因素對絞股藍中黃酮得率的影響順序為：微波功率>料液比>微波溫度>乙醇體積分數(shù)>微波時間。正交實驗所得的最優(yōu)工藝為：A₃B₃C₃D₄E₂，即微波功率300W，微波時間10min，微波溫度70℃，料液比1：25g/mL。乙醇體積分數(shù)30%。為了驗證正交實驗確定的工藝參數(shù)，根據(jù)條件進行三次平行實驗，以黃酮得率為指標，評價其優(yōu)越性，三次平行提取的黃酮得率為4.876mg/g、4.913mg/g、4.905mg/g，平均得率為4.898mg/g，高于正交和單因素實驗中的任何組合，因此確定其為最佳工藝條件。

從表3的方差分析結(jié)果可以看出，微波功率對提取效果影響最顯著，F(xiàn)值最大，其次為料液比、微波溫度、乙醇體積分數(shù)、微波時間，這和正交極差分析的結(jié)果吻合。因此在絞股藍黃酮的提取過程中要嚴格控制微波功率，可以適當?shù)臏p小對提取效果影響最小的微波時間，達到低耗高效的提取效果。

結(jié)論

（1）微波提取絞股藍具有提取時間短、效率高、節(jié)省提取劑、綠色環(huán)保等特點。微波提取絞股藍黃酮過程中，各因素對絞股藍中黃酮得率的影響順序為：微波功率>料液比>微波溫度>乙醇體積分數(shù)>微波時間。

（2）正交優(yōu)化所得的最佳提取工藝條件為：微波功率300W，微波時間10min，微波溫度70℃，料液比1：25g/mL，乙醇體積分數(shù)30%。此條件黃酮得率達4.898mg/g。采摘末期的絞股藍中黃酮含量豐富。作為綠色的植物黃酮資源。在飼料中進行合理開發(fā)利用，會創(chuàng)造更多的經(jīng)濟價值。endprint