雷建林

2017年10月4日，瑞典皇家科學(xué)院宣布2017年度諾貝爾化學(xué)獎授予對冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展做出原創(chuàng)性貢獻(xiàn)的3位科學(xué)家，他們分別是瑞士洛桑大學(xué)的退休榮譽(yù)教授Jacques Dubochet、美國哥倫比亞大學(xué)的Joachim Frank教授和英國劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Richard Henderson教授。

1 異軍突起的冷凍電鏡技術(shù)

結(jié)構(gòu)決定功能，無論是宏觀大到宇宙的天文，還是微觀小到細(xì)胞內(nèi)部的生命，莫不如此。生命科學(xué)從宏觀到微觀，即從器官、組織、細(xì)胞、細(xì)胞器到生物大分子等分子層面，其研究內(nèi)容無不涉及到結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，這也是諾貝爾獎持續(xù)多次授予生物大分子結(jié)構(gòu)解析的原因。X射線晶體學(xué)（X-ray crystallography）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和冷凍電鏡（cryo-electron microscopy，Cryo-EM）三維重構(gòu)（three-dimensional reconstruction，3DEM）是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的3大研究技術(shù)。X射線晶體學(xué)和核磁共振技術(shù)都有著先天性的一些缺陷，比如，X射線晶體學(xué)技術(shù)要求必須將樣品制作為晶體，生物分子尤其是分子量大的生物分子結(jié)晶非常困難，對溶液內(nèi)樣品使用的核磁共振技術(shù)對樣品本身有限制，它只能應(yīng)用于相對較小的蛋白質(zhì)。冷凍電鏡技術(shù)有著其鮮明的優(yōu)點(diǎn)：不需要結(jié)晶，溶液樣品通過快速冷凍方法包埋在一層玻璃態(tài)冰中更接近于其生理狀態(tài)，可同時獲得多個狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，可研究其動態(tài)的結(jié)構(gòu)，所需樣品量極少。盡管如此，長期以來，X射線晶體學(xué)技術(shù)占據(jù)著絕對的統(tǒng)治地位。冷凍電鏡技術(shù)一直是這3大技術(shù)中最弱的一個，因其結(jié)構(gòu)解析的分辨率低，甚至有時被嘲笑為blobology（只能看見一堆輪廓的技術(shù)），但一直在不停地進(jìn)步著，結(jié)構(gòu)解析分辨率逐漸提升，直到最后一個障礙被成功突破——直接電子探測器開始被用于記錄電鏡圖像，從而產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍。2013年底，加州大學(xué)舊金山分校程亦凡研究組和David Julius研究組合作首次利用直接電子探測器K2相機(jī)和冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析了TRPV1膜蛋白3.4 ?近原子分辨率結(jié)構(gòu)，一場冷凍電鏡技術(shù)掀起的結(jié)構(gòu)生物學(xué)革命開始了，冷凍電鏡技術(shù)迅速取代X射線晶體學(xué)技術(shù)成為最重要的結(jié)構(gòu)解析手段。

2 3位獲獎?wù)咴谶@一領(lǐng)域的突出貢獻(xiàn)

2013年之前，冷凍電鏡單顆粒技術(shù)其實(shí)已經(jīng)相當(dāng)成熟，正所謂萬事俱備，只欠東風(fēng)，這也是為什么直接電子探測器研發(fā)成功投入使用之后，短短4年時間冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用就能迅速催生一系列重要的發(fā)現(xiàn)，以及諾貝爾獎如此快地青睞冷凍電鏡技術(shù)的原因。

冷凍電鏡技術(shù)的進(jìn)步是過去幾十年眾多科學(xué)家共同努力的結(jié)果，這3位科學(xué)家的貢獻(xiàn)尤為突出，諾貝爾獎頒給他們自有其原因。

諾貝爾獎一向青睞原創(chuàng)的突破性技術(shù)，各種顯微成像技術(shù)也不例外。1953年荷蘭科學(xué)家Frits Zernike因發(fā)明相襯顯微鏡獲得諾貝爾物理學(xué)獎。最近的一次則是2014年Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E.Moerner因開發(fā)超分辨率熒光顯微技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎。電子顯微鏡技術(shù)與諾貝爾獎也頗有淵源。1931年德國科學(xué)家Ernst Ruska和Max Knoll制造了世界上第一臺透射電鏡，因其在電子光學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)性工作，Ruska和掃描隧道顯微鏡的研制者Gerd Binnig及Heinrich Rohrer一起分享了1986年度諾貝爾物理學(xué)獎。準(zhǔn)晶的發(fā)現(xiàn)也要?dú)w功于透射電鏡。1982年，以色列科學(xué)家Dan Shechtman在急冷的鋁錳合金中發(fā)現(xiàn)5次對稱的電子衍射花樣，后來被證明為來自于急冷合成的二十面體準(zhǔn)晶，他也因這項(xiàng)工作獲得了2011年度諾貝爾化學(xué)獎。世界上僅有美國Thermo Fisher Scientific（原FEI公司，生產(chǎn)基地在歐洲）、日本電子（JEOL）和日本日立（Hitachi）等知名企業(yè)能夠生產(chǎn)商業(yè)化的透射電子顯微鏡（注：德國蔡司Zeiss在這場革命來臨的前夜于2013年退出透射電鏡的制造領(lǐng)域）。電鏡在材料研究領(lǐng)域應(yīng)用非常成功，比較容易獲得原子分辨率的結(jié)構(gòu)，但在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用要明顯落后于材料科學(xué)，原因在于電鏡必須在高真空下才能工作，而生物樣品含有水分才會穩(wěn)定，水分的揮發(fā)會破壞其真空。因此傳統(tǒng)的生物電鏡采用負(fù)染技術(shù)，即讓重金屬鹽包被蛋白表面，然后脫水干燥制作成適合在真空成像的樣品。1968年，英國劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Aaron Klug博士和其同事David DeRosier提出了電鏡三維重構(gòu)原理，并用于解析負(fù)染的噬菌體病毒的結(jié)構(gòu)。Klug博士因此榮獲1982年度諾貝爾化學(xué)獎。然而負(fù)染的方法并不適合，不僅會導(dǎo)致樣品分辨率降低，更重要的是當(dāng)生物分子失水后，它們的結(jié)構(gòu)將坍塌，喪失自然結(jié)構(gòu)特征。因此，必須解決生物樣品脫水失活的問題以及不耐電子輻照損傷的問題。

加州大學(xué)伯克利分校Lawence Berkeley國家實(shí)驗(yàn)室的Robert Glaeser和他的學(xué)生Kenneth Taylor于1974年首次嘗試了將生物大分子過氧化氫酶的二維晶體進(jìn)行冷凍并觀察到3 ?的原子分辨率的電子衍射花樣，說明通過冷凍的方法可以維持含水樣品的高真空以及有效降低輻照損傷對生物樣品精細(xì)結(jié)構(gòu)的破壞。通常的冷凍過程中，樣品里的水會結(jié)成冰晶，可能使樣品結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Jacques Dubochet系統(tǒng)研究了冰在各種冷凍條件下的狀態(tài)，1982年開發(fā)出真正成熟可用的快速冷凍制樣技術(shù)，使水在液態(tài)形式下固化，形成一種玻璃態(tài)冰而不是冰晶來包埋樣品。他們一開始嘗試用液氮直接冷凍但不成功，最后是用乙烷代替液氮后才最終實(shí)現(xiàn)，而乙烷本身則需要用液氮進(jìn)行冷卻，這種方法一直被后來者沿用至今。這項(xiàng)工作標(biāo)志著冷凍電鏡技術(shù)真正的開始。

冷凍電鏡技術(shù)主要包括3種不同的方法：單顆粒分析（single particle analysis），電子斷層術(shù)（electron tomography），電子晶體學(xué)（electron crystallography）。本次諾貝爾獎的頒發(fā)主要還是源于單顆粒分析技術(shù)最近幾年的廣泛應(yīng)用催生了一系列重要發(fā)現(xiàn)。而Joachim Frank則是當(dāng)之無愧的單顆粒分析技術(shù)鼻祖。1975年，Richard Henderson和Nigel Unwin提出了電子晶體學(xué)方法，但是二維晶體非常難以獲得。Joachim Frank開發(fā)了更加普適的單顆粒方法。生物大分子都是由輕元素構(gòu)成，與高能電子相互作用較弱，同時還不耐電子輻照，不能接受很高的劑量，因此圖像的信噪比很低。Joachim Frank提出可基于各個分散的全同顆粒的二維投影照片，經(jīng)過分類對位（alignment）及平均來降低噪音，從而獲取準(zhǔn)確取向，最終得到更高分辨率的三維立體圖像。他還開發(fā)了冷凍電鏡第一個單顆粒三維重構(gòu)軟件SPIDER。另外Joachim Frank將該方法應(yīng)用于核糖體結(jié)構(gòu)機(jī)理方面的研究并作出了重要開創(chuàng)性工作，可惜囿于當(dāng)時冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析分辨率不夠高，遺憾地與2009年授予核糖體結(jié)構(gòu)解析的諾貝爾化學(xué)獎失之交臂。此次因單顆粒分析方法獲得諾貝爾獎，終于沒有再留下遺憾。

Richard Henderson是冷凍電鏡技術(shù)的引領(lǐng)者，1975年首次提出電子晶體學(xué)方法，用其獲得細(xì)菌視紫紅質(zhì)7 ?分辨率的結(jié)構(gòu)，并于1990年推進(jìn)到3.5 ?。首次證明了利用冷凍電鏡技術(shù)是可以獲得原子級分辨率的，盡管只是二維晶體還沒有普適性。他1995年從理論上預(yù)言冷凍電鏡技術(shù)未來完全有能力解析到原子級分辨率，2004年進(jìn)一步指出達(dá)到這個目標(biāo)需要克服的關(guān)鍵問題，一是提高圖像的信噪比，二是克服圖像的漂移。其理論分析為冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展指明了方向，其中一個最重要的方向是直接電子探測器的開發(fā)。他還親自參與了Falcon直接電子探測器的研發(fā)。直接電子探測器的引入，解決了他指出的問題。Richard Henderson還獨(dú)具慧眼，提攜當(dāng)時還不太知名的Sjors Scheres，將其引進(jìn)至MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，后者開發(fā)的基于概率統(tǒng)計(jì)分析的三維重構(gòu)軟件Relion能更有效地處理低信噪比的冷凍電鏡圖像。硬件與軟件的快速發(fā)展，掀起了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的一場革命。

3位獲獎?wù)叨啻蔚街袊M(jìn)行交流訪問，其中Joachim Frank和Richard Henderson和中國頗有淵源。Joachim Frank實(shí)驗(yàn)室有許多華人學(xué)生和學(xué)者，為中國培養(yǎng)了不少該領(lǐng)域的研究人員。北京大學(xué)的高寧教授2002—2006年跟隨Frank攻讀博士學(xué)位，2006—2008年又在其實(shí)驗(yàn)室做博士后，隨后回到清華大學(xué)建立實(shí)驗(yàn)室，后于2017年4月轉(zhuǎn)至北京大學(xué)工作。清華大學(xué)雷建林2000年11月—2009年2月在Frank實(shí)驗(yàn)室先后做博士后和副研究員（associate research scientist），后回到清華大學(xué)協(xié)助建設(shè)國內(nèi)首個頂級冷凍電鏡平臺，目前任清華大學(xué)冷凍電鏡平臺總管。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部教授尹長城早年在劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)，其導(dǎo)師Nigel Unwin和Richard Henderson一起發(fā)展了電子晶體學(xué)方法。

3 中國冷凍電鏡領(lǐng)域發(fā)展現(xiàn)狀

在這場冷凍電鏡技術(shù)引起的結(jié)構(gòu)生物學(xué)革命中，華人學(xué)者也做出了重要貢獻(xiàn)。從2008開始，在直接電子探測器問世之前，美國Brandeis大學(xué)Nikolaus Grigorieff研究組的張興博士（后加入周正洪研究組），德克薩斯大學(xué)休斯敦醫(yī)學(xué)院/加州大學(xué)洛杉磯分校的周正洪教授和他實(shí)驗(yàn)室的余學(xué)奎、張興博士利用Kodak SO-163膠片或CCD相機(jī)解析了多個病毒近原子級分辨率的結(jié)構(gòu)，最高的分辨率達(dá)到3.3 ?，這是首批利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)重構(gòu)出的生物大分子的原子結(jié)構(gòu)。但是利用傳統(tǒng)的膠片或CCD相機(jī)只有病毒等個別具有高對稱的生物大分子有可能利用單顆粒方法做到原子級分辨率。2011年左右，一種全新的圖像記錄設(shè)備直接電子探測器開始揭開其神秘的面紗。2013年初，程亦凡課題組（第一作者李雪明博士）和英國MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的Sjors Scheres課題組（第一作者白曉晨博士）分別獨(dú)立發(fā)表論文，證明利用直接電子探測器并結(jié)合新的圖像處理工具可以解析生物大分子的原子分辨率結(jié)構(gòu)。2013年底加州大學(xué)舊金山分校程亦凡研究組和David Julius研究組合作首次利用直接電子探測器和冷凍電鏡單顆粒技術(shù)解析了TRPV1膜蛋白3.4 ?的結(jié)構(gòu)，一夜之間直接掀起了這一場結(jié)構(gòu)生物學(xué)革命。李雪明、張興、余學(xué)奎博士分別回到清華大學(xué)、浙江大學(xué)、中國科學(xué)院上海藥物研究所組建獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室。

20世紀(jì)90年代中期，清華大學(xué)隋森芳教授、中山大學(xué)張景強(qiáng)教授、中國科學(xué)院生物物理研究所徐偉研究員等人開始利用冷凍電鏡開展研究。隋森芳院士是中國冷凍電鏡領(lǐng)域的先驅(qū)，不僅利用冷凍電鏡技術(shù)研究與生物膜相關(guān)的重要蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能做出了非常重要的工作，還培養(yǎng)了一批冷凍電鏡領(lǐng)域的優(yōu)秀青年科學(xué)家，這些科學(xué)家各自建立了獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室，包括清華大學(xué)的王宏偉、上?？萍即髮W(xué)的沈慶濤、西安交通大學(xué)的武一、天津大學(xué)的米立志、美國Wadsworth中心的劉錚、NIH的江健森、西南醫(yī)學(xué)中心的白曉晨和普渡大學(xué)的暢磊福。

中國早期的冷凍電鏡設(shè)備非常落后，2008年以前沒有一臺場發(fā)射冷凍透射電鏡。真正的發(fā)力開始于2008年，清華大學(xué)率先訂購亞洲第一臺Titan Krios高端冷凍電鏡，該儀器于2009年3月到貨，幾個月后中國科學(xué)院生物物理研究所的Titan Krios也到貨。其后，隨著國家蛋白質(zhì)科學(xué)研究基礎(chǔ)設(shè)施的啟動，蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施以及清華大學(xué)分別在2013年和2015年第4季度各有1臺和2臺Titan Krios電鏡投入使用。近年，隨著冷凍電鏡技術(shù)的革命，中國科學(xué)院生物物理研究所、北京大學(xué)、浙江大學(xué)紛紛購置了Titan Krios電鏡并投入使用，更多的高校與科研機(jī)構(gòu)也都已經(jīng)或計(jì)劃購置高端冷凍電鏡。截止到2017年11月，中國將共有各種型號的冷凍電鏡近50臺，其中最高端的冷凍電鏡約14臺（含已到貨暫未完成安裝的）。到2018年年底，最高端冷凍電鏡的數(shù)字將可能增至近30臺。

近年來，在冷凍電鏡技術(shù)的應(yīng)用方面，中國科學(xué)家取得了優(yōu)異的成績。如，清華大學(xué)施一公研究組首次報(bào)道了通過單顆粒冷凍電鏡方法解析的酵母剪接體近原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)，并闡述了剪接體對前體信使RNA執(zhí)行剪接的基本工作機(jī)理；隨后又陸續(xù)解析了酵母剪接體多個處于不同狀態(tài)的結(jié)構(gòu)；2017年施一公課題組又首次解析了人源剪接體近原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)。清華大學(xué)隋森芳課題組獲得了第一個完整藻膽體的近原子分辨率的三維結(jié)構(gòu)，也是迄今為止報(bào)道過的分辨率好于4 ?的最大的蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)。清華大學(xué)顏寧課題組解析了一系列不同的離子通道的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。清華大學(xué)楊茂君課題組解析了一系列線粒體呼吸鏈蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。中國科學(xué)院生物物理研究所朱平研究組和李國紅研究組合作解析了30 nm染色質(zhì)左手雙螺旋高清晰三維結(jié)構(gòu)。中國科學(xué)院生物物理研究所柳振峰研究組、章新政研究組與常文瑞、李梅研究組合作，先后報(bào)道了菠菜和豌豆光系統(tǒng)-捕光復(fù)合物的超級膜蛋白復(fù)合體的高分辨率電鏡結(jié)構(gòu)。中國科技大學(xué)的蔡剛課題組解析了3.9 ?分辨率的ATRATRIP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)揭示了ATR激酶活性在同源二聚體中活性抑制和激活的分子機(jī)制。

在冷凍電鏡技術(shù)的開發(fā)方面，中國科學(xué)家也取得了一系列成果。如，清華大學(xué)的王宏偉課題組和合作者首次提出并使用過焦成像技術(shù)獲得高分辨率蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，是冷凍電鏡成像理論方面的新方法，同時此方法也為球差矯正技術(shù)和相位板技術(shù)在生物冷凍電鏡領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新思路。清華大學(xué)的李雪明課題組和合作者開發(fā)了基于深度學(xué)習(xí)技術(shù)的自動挑顆粒軟件DeepPicker、單顆粒重構(gòu)軟件Thunder以及單顆粒、微晶衍射（MicroED）數(shù)據(jù)收集軟件。清華大學(xué)王佳偉和其合作者開發(fā)了為高分辨率冷凍電鏡三維重構(gòu)密度圖自動建模的程序EMBuilder。清華大學(xué)的雷建林在原有開發(fā)基礎(chǔ)上，發(fā)展了全新的高通量單顆粒自動化數(shù)據(jù)收集軟件AutoEMation 2.0并廣泛使用。中國科學(xué)院生物物理研究所的孫飛和其合作者得出以下成果：1）提出了一種全新的高真空光學(xué)冷臺設(shè)計(jì)思想，自行研發(fā)了一套基于高真空光學(xué)冷臺的光電關(guān)聯(lián)成像系統(tǒng)HOPE；2）開發(fā)了連續(xù)超薄切片掃描電鏡成像AutoCUTS-SEM大尺度生物樣品電鏡三維重構(gòu)新技術(shù)；3）提出了一種改進(jìn)的冷凍聚焦離子束切割方法；4）開發(fā)了新型的電子斷層三維重構(gòu)新方法。湖南師范大學(xué)的劉紅榮和其合作者提出了一種基于二維電子顯微圖像重構(gòu)對稱失配生物大分子三維結(jié)構(gòu)的新方法，首次揭示了病毒內(nèi)部基因組及其聚合酶的三維結(jié)構(gòu)。

華人科學(xué)家在這個領(lǐng)域的影響力越來越大，3DEM Gordon Research Conference是這個專業(yè)領(lǐng)域最重要的國際會議，2016年的大會主席是加州大學(xué)舊金山分校程亦凡教授，2019年將由清華大學(xué)王宏偉教授擔(dān)任。首屆Kuo KH International Symposium on 3D Cryo-EM Molecular Imaging于2008年由清華大學(xué)承辦，這也正式標(biāo)志著中國冷凍電鏡群體的快速崛起。兩年一度的該研討會越來越成為該領(lǐng)域僅次于3DEM Gordon Research Conference的國際盛會，3位諾貝爾獎獲得者過去曾多次參加該會。下一屆將于2018年8月在杭州舉行，由浙江大學(xué)承辦，Joachim Frank教授早就明確表示將參加。2016年成立了中國生物物理學(xué)會冷凍電鏡分會，到目前為止，國內(nèi)從事冷凍電鏡相關(guān)工作的課題組約有50個，相信今后幾年會員數(shù)會迅速增長。

4 展望

2015年《Nature Methods》將冷凍電鏡技術(shù)評為年度最受關(guān)注的技術(shù)，2017年冷凍電鏡技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎實(shí)至名歸。今后，冷凍電鏡單顆粒技術(shù)的應(yīng)用必然會更加普及，對于重要生物大分子的結(jié)構(gòu)解析課題組之間的競爭將更加白熱化。冷凍電鏡技術(shù)是一門交叉學(xué)科，相當(dāng)多的本領(lǐng)域華人科學(xué)家來自于物理和材料等領(lǐng)域也證明了這一點(diǎn)。本次頒獎很多人笑言是物理學(xué)家為了解決生物學(xué)問題而獲得了諾貝爾化學(xué)獎。未來技術(shù)的發(fā)展需要生物、物理、化學(xué)、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)、材料、工程等領(lǐng)域的科學(xué)家通力合作。冷凍電鏡技術(shù)在未來仍有許多重要技術(shù)問題尚待解決。如：1）如何獲得生物大分子結(jié)構(gòu)在細(xì)胞乃至組織原位的更接近生理狀態(tài)的精細(xì)結(jié)構(gòu)信息？2）如何獲得生物大分子的動態(tài)結(jié)構(gòu)信息？3）超大規(guī)模數(shù)據(jù)的快速處理，這需要更好的數(shù)據(jù)處理軟件和計(jì)算機(jī)硬件的共同發(fā)展。4）如何進(jìn)一步提高結(jié)構(gòu)解析分辨率，雖然相位板、能量過濾器、物鏡球差矯正裝置等新硬件設(shè)備的開發(fā)應(yīng)用進(jìn)一步推進(jìn)了冷凍電鏡技術(shù)的極限，目前單顆粒技術(shù)仍然難以獲得好于2 ?分辨率的結(jié)構(gòu)，除了需要更好的算法外，相關(guān)的電鏡和相機(jī)硬件設(shè)備需要更深入的開發(fā)應(yīng)用。5）如何將冷凍電鏡技術(shù)與其它技術(shù)，如超分辨率熒光顯微技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、測序技術(shù)等有機(jī)整合。6）如何發(fā)展更加成熟的MicroED技術(shù)。冷凍電鏡領(lǐng)域目前人才缺口很大，冷凍電鏡技術(shù)在未來大有可為?！?/p>