呂 靜，曲雷鳴，龔 偉

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032

細胞色素P450(cytochrome P450)屬于藥物代謝的第一相酶，主要存在于肝臟微粒體中，是肝臟混合功能氧化酶系(MFO)的主要成份，在內(nèi)源性和外源性化合物的生物轉(zhuǎn)化中起重要作用［1］，CYP450抑制是有害藥物間相互作用(Drug to drug Interactions，DDIs)產(chǎn)生的主要原因，占代償性DDIs 的 70%［2］。有研究表明［3］，隨著年齡的增長，大鼠肝微粒體細胞色素P450的含量減少。在P450s超家族中，CYP1～3是參與藥物代謝的主要家族，參與70%～80%的臨床藥物的生物轉(zhuǎn)化，藥物對其活性及表達的研究有助于了解DDIs或?qū)λ幬锟赡艿亩拘缘茸龀鲱A(yù)測。

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.Et Zucc.的干燥成熟果實，具有補益肝腎的作用，為抗衰老的名貴中藥，臨床上山茱萸常與其他藥物配伍使用，本研究以山茱萸為研究對象，考察其對小鼠肝微粒體細胞色素P450部分亞型 CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41 mRNA 表達的影響，有助于預(yù)測山茱萸與臨床其他藥物之間可能存在的 DDIs，從而指導(dǎo)老年患者臨床合理用藥，避免產(chǎn)生不良反應(yīng)，降低潛在風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種青年小鼠10只，3～4月齡，體質(zhì)量30～35 g，雌雄各半；昆明種老年小鼠30只，大于12月齡，體質(zhì)量大于50 g，雌雄各半，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK(遼)2003-008，實驗動物使用合格證號：SYXK(遼)20090002。

1.2 儀器與試藥 PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)，ROX plustrizol，GAPDH，CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41等均購于大連寶生物工程有限公司；山茱萸藥材由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供；山茱萸含藥鼠糧由遼寧長生生物科技有限公司提供，低、高劑量組含藥鼠糧含山茱萸濃度分別為0.04、0.36 g/g，模型組及對照組給予正常鼠糧。

1.3 方法

1.3.1 分組及給藥 將老年小鼠30只隨機分為3組，分別為老年模型組、山茱萸高劑量組、山茱萸低劑量組，以3～4月齡小鼠為成年對照組。給藥組分別給予不同濃度的含藥鼠糧，老年模型組、成年對照組給予正常鼠糧。

1.3.2 RT-PCR檢測 連續(xù)給藥3個月后，分別用10%水合氯醛麻醉小鼠，固定，剪開腹腔，取肝臟于Trizol中勻漿，使用PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，首先提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成第1鏈互補cDNA，通過特異性引物對小鼠肝組織中的CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41和內(nèi)參基因 GAPDH進行擴增［4］，使用Stratagene Mx3000p熒光定量PCR儀進行檢測，基因引物序列見表1，溶解曲線，擴增曲線，閾值曲線見圖1—3。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

老年模型組小鼠肝微粒體細胞色素P450亞型 CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41基因相對表達量均顯著低于成年對照組大鼠的相關(guān)基因表達。給予不同劑量山茱萸含藥鼠糧后，山茱萸高、低劑量組 CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41基因相對表達量均顯著升高，且山茱萸高劑量組作用強于低劑量組，見表2。

表2 基因相對表達量

3 討論

肝藥酶主要參與藥物代謝，其相關(guān)亞型基因表達量降低，可能是導(dǎo)致藥物代謝緩慢，發(fā)生不良反應(yīng)的主要原因。本研究結(jié)果表明，衰老小鼠肝細胞中 CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41基因的表達量顯著低于成年小鼠，給予含山茱萸的鼠糧后，肝細胞中CYP1A1、CYP2A4、CYP2A5、CYP3A41基因的表達量顯著升高，表明中藥山茱萸有誘導(dǎo)肝藥酶的作用，可為老年人合理用藥提供依據(jù)。

在P450s超家族中CYP1～3是參與藥物代謝的主要家族，參與70%～80%的臨床藥物的生物轉(zhuǎn)化，P450s抑制是臨床治療藥物DDIs主要的成因之一，山茱萸可對P450相關(guān)亞型CYP1A1、CYP2A4、C YP2A5、CYP3A41基因產(chǎn)生誘導(dǎo)，可使其血藥濃度降低，減少由于協(xié)同用藥產(chǎn)生毒性的可能。

CYP1A1參與烴類致癌物的代謝［5］，大多數(shù)化學(xué)致癌物都是CYP1A1的底物［6］。山茱萸能誘導(dǎo)CYP1A1 mRNA的表達，表明該藥長期服用可能導(dǎo)致體內(nèi)致癌代謝物堆積。

小鼠肝中CYP2A5與人肝中CYP2A6有高度的同源性，且功能相似［7-8］，CYP2A6是人體內(nèi)重要的藥物代謝酶，其參與環(huán)磷酰胺、丙戊酸鈉、咖啡因及尼古丁等代謝，山茱萸能誘導(dǎo)CYP2A5 mRNA的表達，當(dāng)山茱萸與通過CYP2A5代謝的其他藥物聯(lián)合應(yīng)用時需謹(jǐn)慎，以避免產(chǎn)生代謝性藥物相互作用導(dǎo)致的藥物不良反應(yīng)。

CYP3A41與CYP2A4目前研究較少，其代謝主要與激素相關(guān)［9］，本研究結(jié)果表明，12月齡老年模型組小鼠肝細胞CYP3A41與CYP2A4 mRNA的表達顯著低于6月齡成年對照組小鼠的基因表達，與12月齡小鼠已進入老年，激素代謝水平降低相關(guān)，山茱萸能誘導(dǎo)CYP3A41與CYP2A4 mRNA的表達，可能與山茱萸能調(diào)節(jié)老年小鼠激素代謝相關(guān)［10］。

［1］K enyon N J，W ard RW，M cgrew G，etal.TG F-bet a1 causes ai rw ay fi brosi s and i ncreased col l agenⅠandⅢm RN A i n m i ce［J］.Thorax，2003，58(9):772-777.

［2］Zanger U M，Schw ab M.Cyt ochrom e P450 enzym es i n drug m et abol i sm:Regul at i on of gene expressi on，enzym e act i vi t i es，and i m pact of genet i c vari at i on［J］.Pharm acol Ther，2013，138(1):103-141.

［3］Schm nckerD L，W ang RK.A ge-rel at ed changes i n l i ver drug-m et abol i zi ng Enzym es［J］.Exp G eront ol，1980，15(5):323-331.

［4］Y e J，Coul ouri s G，Zaret skaya I，et al.Pri m er-BLA ST:A t ool t o desi gn t arget-speci fi c pri m ers for pol y m erase chai n react i on［J］.BM C Bi oi nform at i cs，2012，13：134.

［5］Rannug A，A l exandri e A K，Persson I，et al.G enet i c Pol ym orphi sm of Cyt ochrom es P450 1A 1，2D 6 and 2E1:Regul at i on and Toxi col ogi cal Si gni fi cance［J］.J O ccup Envi ron M ed，1995，37(1):25-36.

［6］LandiM T，Bert azziPA，Shi el ds PG，etal.A ssoci at i on bet w een CY P1A 1 genot ype，m RN A expressi on and enzym at i c act i vi t y i n hum ans［J］.Pharm acogenet i cs and G enom i cs，1994，4(5)：242-246.

［7］U eng Y F，Chen CC，Chung Y T，et al.M echani sm-based i nhi bi t i on of cyt ochrom e P450(CY P)2A 6 by chal epensi n i n recom bi nantsyst em s，i n hum an l i verm i crosom es and i n m i ce i n vi vo［J］.Br J Pharm acol，2011，163(6):1250-1262．

［8］Rauni oa H，Pokel a N，Puhakai nena K，et al.N i cot i ne m et abol i sm and uri nary el i m i nat i on i n m ouse:i n vi t ro and i n vi vo［J］.X enobi ot i ca，2008，38(1)：34-47.

［9］Sakum a T，K i t aj i m a K，N i shi yam a M，et al.Col l aborat ed regul at i on offem al e-speci fi c m uri ne Cyp3a41 gene expressi on by grow t h and gl ucocort i coi d horm ones［J］.Bi ochem i caland Bi ophysi calResearch Com m unicat i ons，2004，314(2):495-500.

［10］蔣淑君，張建榮，王濤，等.山茱萸提取物對腎陽虛大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的影響［J］.濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，31(3):179-181.