王淑棟,張善強,賀思程

(中國石油大學(xué)(華東)計算機與通信工程學(xué)院,青島 266580)

隨著人類基因組測序工作的逐步完成,大量的數(shù)據(jù)為全基因組關(guān)聯(lián)分析提供了豐富的素材,也涌現(xiàn)出許多數(shù)據(jù)分析方法[1-4].人類基因組計劃得出人類所有的基因共由39 000多個已經(jīng)編碼蛋白的基因序列以及30億堿基組成.而國際單體型圖計劃[5]得到了SNP的300萬個位點.兩個計劃的實施給生物學(xué)領(lǐng)域帶來了眾多的數(shù)據(jù)信息,為全基因組研究中提供了方便.GWAS因其優(yōu)勢得到了很多的應(yīng)用.大量研究成果顯示關(guān)聯(lián)研究具有很多的優(yōu)勢[6].

Ghoussaini等[7]在2012年針對乳腺癌相關(guān)基因進行研究,共得到了3個致病相關(guān)的位點,rs10771399不僅在乳腺癌的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,在骨轉(zhuǎn)移中也有著同樣的重要性.2013年,維爾漢姆等[8]關(guān)于躁郁癥的數(shù)據(jù)進行分析,得出與躁郁癥相關(guān)的SNP位點及致病基因.2014年,廣川等[9,10]針對心肌梗塞病設(shè)計了病例對照實驗,從實驗中得到了有關(guān)疾病的致病基因和SNP,使心肌梗塞病得到了合理的解釋.

GWAS能夠幫助人們更好的解釋復(fù)雜疾病成因,但是它也有不足.一方面,復(fù)雜疾病多種多樣,其中的影響因素也很多,如何確切地得到與特定的功能相聯(lián)系的位點是個不小的難題;另一方面,對于GWAS結(jié)果,它在不同群體中的影響程度并不一樣;目前的大部分研究主要針對簡單疾病,沒有涉及到基因間的相互作用.

而針對基因間的相互作用,可以通過互信息建立網(wǎng)絡(luò)進行表達.GWAS網(wǎng)絡(luò)方法將GWAS數(shù)據(jù)進行網(wǎng)絡(luò)建模,通過比較疾病數(shù)據(jù)與對照數(shù)據(jù)得出的網(wǎng)絡(luò)的不同,進行后續(xù)的相關(guān)統(tǒng)計量的分析及解釋.

本文試圖通過互信息表示SNP之間的相互作用關(guān)系,進而建立SNP與SNP之間的網(wǎng)絡(luò).在此基礎(chǔ)上,進行全基因組關(guān)聯(lián)研究,找到結(jié)構(gòu)性關(guān)鍵SNPs.

1 互信息網(wǎng)絡(luò)建模

隨著生物網(wǎng)絡(luò)的研究深入發(fā)展,研究者對元素之間的相關(guān)性的描述越來越準確,互信息作為兩個元素之間的相關(guān)信息度量,具有很多的優(yōu)勢,其中最具優(yōu)勢的就是它的熵表示,不僅是對元素出現(xiàn)概率的表示,更是體現(xiàn)了元素之間的離散程度及相互之間的關(guān)系,對于給定的兩個SNP表達序列,他們之間的數(shù)據(jù)存在著差異,而利用互信息可以充分表達SNP之間的差異性及依賴性,互信息越大,說明兩個SNP之間的關(guān)聯(lián)程度越緊密;反之,則說明聯(lián)系越小,從而找到跟所有的SNP聯(lián)系較大的節(jié)點,即是關(guān)鍵SNP.本文通過互信息建立相互作用網(wǎng)絡(luò),從而分析網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的差異性.設(shè)是兩個SNP的基因型數(shù)據(jù)在個體之間表達形成的向量,是X和Y的聯(lián)合概率分布,是他們之間的聯(lián)合熵,定義為:

對于兩個隨機變量之間存在的關(guān)系,H(X)表示隨機變量X蘊含的不確定性,而條件熵則是已知條件Y時隨機變量X所余下的不確定性,那樣,就表示已知條件Y后X包含的信息量.進而還可以證明這個值關(guān)于X和Y是對稱的,即且都等于由此X和Y之間的互信息可以計算,互信息記為

因為SNP數(shù)據(jù)是每個SNP仿真1000組得到的數(shù)據(jù),每三個數(shù)據(jù)代表一個個體,首先需要對數(shù)據(jù)進行處理使得數(shù)據(jù)能夠表示基因型,我們確定使用0,1,2三個數(shù)來表示每個個體內(nèi)表達的基因型,再根據(jù)公式(2)計算得到所有的SNP之間的互信息.具體計算過程如下:

(1)我們首先得到每個SNP的基因型可能性序列數(shù)據(jù),假設(shè)共有N個個體,則每一行包含2N個SNP堿基可能性數(shù)據(jù),0代表出現(xiàn),1代表不出現(xiàn).

例如:假定兩個個體關(guān)于5個SNPs的基因型數(shù)據(jù)如下:

SNP 1:AA AA

SNP 2:GG GT

SNP 3:CC CT

SNP 4:CT CT

SNP 5:AG GG

輸出的正確仿真數(shù)據(jù)如下所示:

SNP1 rs1 1000 A C 1 0 0 1 0 0

SNP2 rs2 2000 G T 1 0 0 0 1 0

SNP3 rs3 3000 C T 1 0 0 0 1 0

SNP4 rs4 4000 C T 0 1 0 0 1 0

SNP5 rs5 5000 A G 0 1 0 0 0 1

所以,在SNP3上,兩個等位基因上堿基分別為C和T,所以每個個體與之相對應(yīng)的堿基組合CC,CT,TT出現(xiàn)的可能性序列分別是100和010.

(2)每個SNP的基因型表達數(shù)據(jù)作為一個向量,x,y表示來自SNP集合I中的其中的兩個SNP向量.

(3)根據(jù)每個SNP的基因型表達量的分布,計算得到每兩個SNP之間存在的互信息值.所有SNP之間的互信息構(gòu)成互信息矩陣,記作矩陣中的每行代表一個SNP,每一列代表此SNP與另一個SNP之間的互信息.

假定存在一個集合的SNP基因型數(shù)據(jù)D,其中所擁有的SNP的集合我們記作I,可由互信息計算公式(2)得到一個互信息矩陣.定義一個建立在關(guān)于SNP基因型數(shù)據(jù)D的互信息網(wǎng)絡(luò).是邊賦權(quán)圖,其中V表示點集合、每個網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點i∈V表示一個SNP,基因i和j之間的互信息計算值wij定義為每條邊的權(quán)重.在下面的表述中,我們將基因i∈I以及頂點i∈V等同起來看待.

2 基于網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計量的關(guān)鍵基因選取

利用上述方法得到的SNP相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(SNP)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參數(shù)來描述特定生物過程中基因的重要性.首先給出幾個重要的能夠反映網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特點的網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計量的相關(guān)定義[11].

(1)度(K):在網(wǎng)絡(luò)中,度指的是與該點相連接的邊數(shù)目.節(jié)點度可以表示該點的重要程度,節(jié)點度越大,表示該點在網(wǎng)絡(luò)中越重要.而網(wǎng)絡(luò)的平均度可以通過計算所有的點的度,后取平均數(shù)計算得到.

(2)平均路徑長度(L):定義為網(wǎng)絡(luò)中所有的點之間兩兩求得的距離的平均數(shù),網(wǎng)絡(luò)中的任意兩點i,j的距離即邊的條數(shù),則兩點之間的平均路徑長度表示為所有的點之間的平均距離,記作:其中N表示網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點數(shù)目.

(3)聚類系數(shù)(C):網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點i有Ki個邊與之連接,那么與該點可能連接的最大邊數(shù)為若這Ki個節(jié)點之間真實邊為Ei,則它與總的所有情況下的邊比例,計算得到節(jié)點i的聚類系數(shù)很顯然,0≤C≤1.C=0代表網(wǎng)絡(luò)中的點為孤立點;C=1表示網(wǎng)絡(luò)中的所有點之間都是互相連接的,視為全局耦合網(wǎng)絡(luò).

(4)介數(shù)(B):網(wǎng)絡(luò)中介數(shù)的概念可以分為兩類,一類是點介數(shù),另一類是邊介數(shù).節(jié)點k的介數(shù)定義為,其中,C(i,j)代表i與j間最短路徑總數(shù),表示中間點為k時,i與j間的所有路徑總數(shù).介數(shù)反映了節(jié)點k在i和j之間的流通量和重要程度.網(wǎng)絡(luò)中某個節(jié)點的介數(shù)越大,說明該點在網(wǎng)絡(luò)中信息傳播的信息量就越大,越容易在該點造成網(wǎng)絡(luò)堵塞.假設(shè)兩組連接度很高的網(wǎng)絡(luò)中間只有少數(shù)點連接,那么這幾個少數(shù)點介數(shù)就會很大,即很多的信息在流通的過程中經(jīng)過這幾個點,很容易造成堵塞,從而造成數(shù)據(jù)信息丟失.因此,最大介數(shù)的增大會降低網(wǎng)絡(luò)同步能力.

(5)模塊度(Q):模塊度也稱作模塊化度量值,是用來衡量網(wǎng)絡(luò)強度的統(tǒng)計量.最早是Newman提出的,它用來描述網(wǎng)絡(luò)社團以及劃分的好壞.假定網(wǎng)絡(luò)共分為k個社團,代表一個k×k維的矩陣.故模塊度可以定義為:其中,是矩陣中的數(shù)值之和(行或列),eij用來表示社區(qū)i和社區(qū)j之間的邊的數(shù)量.模塊度可以區(qū)分社區(qū)劃分的好壞.若是劃分的好,則社區(qū)內(nèi)部節(jié)點相似度較大,而在社區(qū)外邊相似度較低.Q越大,越接近1,代表社區(qū)擁有一個很好的劃分結(jié)構(gòu),使得社區(qū)的劃分合理化.通常設(shè)定的值是在0.3與0.7之間.

本文中我們主要選擇5個參數(shù)進行分析比較,對于給定的參數(shù)進行最終的分析,從而找到影響網(wǎng)絡(luò)的重要因素,依據(jù)此類統(tǒng)計量進行歸納分析,得出相應(yīng)的參數(shù).

我們對由SNP數(shù)據(jù)設(shè)定不同的互信息閾值而形成網(wǎng)絡(luò),針對其中大于閾值的邊,做去掉處理,而針對小于閾值的邊進行保留操作,從網(wǎng)絡(luò)圖可以分析出統(tǒng)計量所對應(yīng)的參數(shù)變化,得到有益信息量.

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中SNP之間互信息計算的值,選擇閾值范圍為0.1到0.63.共設(shè)置63個閾值,在每個閾值的條件下,統(tǒng)計計算相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)果,從而得到一致性網(wǎng)絡(luò),根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的相似性程度選擇對實驗組和對照組差別較大的統(tǒng)計量進行分析.我們最終選擇了度作為區(qū)分依據(jù),并分析能夠區(qū)分實驗組和對照組的取值范圍,得出最佳的閾值,對于不同的數(shù)據(jù),得到的互信息值也不同,所以需要根據(jù)數(shù)據(jù)得到的互信息范圍,由網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計量得到取值范圍,得到互信息取值的交集,能夠區(qū)分對照組和實驗組數(shù)據(jù),從而確定最佳的互信息閾值.這樣就能夠保證所取的閾值不受樣本數(shù)量的大小影響,而是根據(jù)樣本的不同情況得到相應(yīng)的閾值.對于節(jié)點i,我們定義,?d代表了這個節(jié)點的度差異值,在該公式中,分別代表了這個節(jié)點在實驗組與對照組網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的度.

我們都知道,在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中,節(jié)點度能夠代表節(jié)點的作用和影響力.本文從網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)差異的角度去衡量各個統(tǒng)計量[12],進而對應(yīng)到其中的節(jié)點,找到“結(jié)構(gòu)性關(guān)鍵SNPs”.這種差異性貢獻分為正、負貢獻兩個方面.我們用r代表度的變化閾值.正貢獻SNP代表了該節(jié)點在病例組、對照組兩個網(wǎng)絡(luò)中度的貢獻?d≥r的SNP;同理,負貢獻SNP代表了該節(jié)點在以上兩個網(wǎng)絡(luò)中度的貢獻?d≤-r的SNP.

本文對基因BRCA2仿真數(shù)據(jù)建立病例組與對照組建立相互作用網(wǎng)絡(luò)進行數(shù)據(jù)實驗.對SNP互信息設(shè)置一個閾值范圍,分析產(chǎn)生的病例組和對照組SNPs互信息網(wǎng)絡(luò)的統(tǒng)計量:平均路徑長度、聚類系數(shù)、平均度、模塊度、平均介數(shù)隨閾值在其變化范圍內(nèi)的增加而變化的情況.根據(jù)計算的網(wǎng)絡(luò)中SNP之間互信息的值,我們?nèi)』バ畔㈤撝档姆秶鸀?至0.63,步長0.01,分析對應(yīng)病例組與對照組的SNP相互作用網(wǎng)絡(luò)的上述網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)參數(shù)隨變化而變化的情況.

3 數(shù)據(jù)來源與處理

HapMap給出了人類基因組單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和拷貝數(shù)多態(tài)性(CNPs)的分布情況.本文使用HapMap提供的三個文件進行實驗,包含了關(guān)于BRCA2的88個SNPs.下面是對三個文件的說明.

.hap文件是已知的單體型數(shù)據(jù),其中行代表SNP,列表示單體型.每一個.hap文件都需要一個相應(yīng)的legend文件,所有的等位基因都以0,1作為標(biāo)記.

.legend文件是SNP標(biāo)記位點數(shù)據(jù),四列數(shù)據(jù)分別表示SNP的ID、堿基位置、堿基的0,1表示.

.map文件包含了小規(guī)模的重組率,共三列分別表示每個SNP的物理位置,距離左標(biāo)記點的位置和距離右標(biāo)記點的位置.

在這數(shù)據(jù)中,必須去掉全部為0或者全部為1的數(shù)據(jù),因為這些數(shù)據(jù)對構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)沒有任何幫助.去掉這些多余的數(shù)據(jù),共得到45條SNP數(shù)據(jù).把3個文件放到一起,執(zhí)行Hapgen2軟件,代碼如下:

./hapgen2 -m BRCA2.map -l BRCA2.legend -h BRCA2.hap -o BRCA2.out -dl 31820136 1 2.5 2 31847382 0 1.5 4.5 -n 5000 5000.

分別仿真了5000組實驗組和對照組數(shù)據(jù).隨機選定2個SNPs作為致病SNPs.它們的信息如下:rs206081和rs9534318,選取雜合子變異率分別是2.5和1.5,純合子變異率分別為2和4.5,上述樣本數(shù)據(jù)都包含SNP編號,SNP位置及0,1表達數(shù)據(jù).

本文中,我們使用.gen文件,刪除前五列后把數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成一個矩陣,其中每行表示一個向量,每三個數(shù)字代表一個個體,我們轉(zhuǎn)換成0,1,2表示.

4 試驗方法和結(jié)果

4.1 網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計量的比較

根據(jù)得到的互信息矩陣,大于閾值的向量之間表示相互關(guān)系較強,選定這些SNP作為節(jié)點建立網(wǎng)絡(luò).分析比較網(wǎng)絡(luò)的6個特性.每個結(jié)構(gòu)參數(shù)都反映著網(wǎng)絡(luò)的特性,進而可以顯示SNP間的互信息的變化,取0.01為步長,從0到0.63之間求得每一個閾值下的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特性值,得到圖1.圖1中,縱坐標(biāo)表示相應(yīng)的統(tǒng)計量,橫坐標(biāo)代表閾值,虛線表示對照組數(shù)據(jù)顯示效果,實線表示實驗組數(shù)據(jù)顯示效果.

圖1 4個網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計量隨閾值的增加的變化情況

實驗發(fā)現(xiàn)5個結(jié)構(gòu)特性中,平均聚類系數(shù)B交織在一起,不能區(qū)分實驗組和對照組.

觀察圖1(a),當(dāng)0＜t＜0.21時,網(wǎng)絡(luò)的平均介數(shù)B在在兩組中的變化趨勢走向大體相似.當(dāng)0.21＜t＜0.63時,網(wǎng)絡(luò)的平均介數(shù)B逐漸減小.從圖中可以明顯的看出,病例組的平均介數(shù)要比對照組的平均介數(shù)高.于是,我們得到,隨著互信息閾值的增大,節(jié)點的介數(shù)也在不斷減小,網(wǎng)絡(luò)中邊越來越稀疏.

觀察圖1(b),當(dāng)0.2＜t＜0.43時,實驗組與對照組的網(wǎng)絡(luò)有相對明顯的差異.于是我們可以得到,在這個變化區(qū)間內(nèi),平均路徑長度可以很好的區(qū)分病例組和對照組,而當(dāng)t＞0.43時,網(wǎng)絡(luò)的邊越來越少,平均路徑長度趨近于0.

從模塊度Q隨閾值的變化圖1(c)看出,當(dāng)閾值0＜t＜0.2 或 0.43＜t＜0.63 時,兩組中的模塊度Q逐步上升,但變化大致相同,而當(dāng) 0.2＜t＜0.43 時,實驗組模塊度與對照組有較大區(qū)別.

觀察圖1(d),可以發(fā)現(xiàn),在很長的一段閾值范圍內(nèi),病例組與對照組的網(wǎng)絡(luò)平均度有很大的區(qū)別,而隨著網(wǎng)絡(luò)的閾值增加,網(wǎng)絡(luò)的平均度越來越小,這與網(wǎng)絡(luò)的孤立點越來越多也是相對應(yīng)的.

當(dāng)t＞0.62時,病例、對照組中都只有一個包含四個節(jié)點的全耦合子網(wǎng),聚類系數(shù)C、平均路徑長度L兩者相等,且都為1.當(dāng)t＞0.63時,平均路徑長度L、聚類系數(shù)C是缺失的,平均介數(shù)B以及其他三個統(tǒng)計量值均為0.

總之,平均聚類系數(shù)C不能區(qū)分兩組數(shù)據(jù),平均路徑長度L和平均介數(shù)B能夠區(qū)分但是閾值具有一定局限性.平均度可以在很大的范圍內(nèi)把實驗組和對照組分別出來,我們選擇平均度作為區(qū)分的依據(jù).

從圖1中我們得到每個統(tǒng)計量能夠區(qū)分兩組的閾值范圍,如表1.

表1 各統(tǒng)計量能夠區(qū)分實驗組和對照組的閾值范圍

從表1可以看出,每一個統(tǒng)計量都有不同的閾值范圍,平均度K的范圍較大,0.08＜K＜0.35;其他的統(tǒng)計量閾值范圍相差不大,基本在0.2到0.3之間.結(jié)合圖1,選擇0.28為閾值構(gòu)建網(wǎng)絡(luò).

依據(jù)圖2,實驗組和對照組的圖像是有很大差異的.在對照組,節(jié)點之間聯(lián)系較弱且存在更多的孤立點.但是在實驗組中,很多的孤立點不再是獨立的,并且擁有了更多的聯(lián)系.對照組中存在36個連接點和9個孤立點,而實驗組中存在39個連接點喝6個孤立點.這表明我們選取的閾值0.28是合適的.經(jīng)過多次仿真數(shù)據(jù)試驗,對于結(jié)合數(shù)據(jù)互信息得到閾值范圍,而后確定互信息閾值的方法都是有效的.

圖2 閾值為0.28的條件下,實驗組和對照組互信息網(wǎng)絡(luò)

4.2 獲得“結(jié)構(gòu)性關(guān)鍵SNP”

結(jié)構(gòu)決定功能,而結(jié)構(gòu)的差異決定了功能的差異,本文將這種差異細化到每個節(jié)點上,而平均度可以很好的區(qū)分病例組和病例組,所以我們選擇每個SNP位點的平均度來刻畫SNP在病例組和對照組的差異,計算每個網(wǎng)絡(luò)的每個節(jié)點的節(jié)點度差異,當(dāng)節(jié)點的度在病例、對照組中的變化差異比較大時,說明這兩個組的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)差異較大.從兩組網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)分析來說,節(jié)點度的增量有正有負,所以,節(jié)點在病例組中的度也有增減之分,即存在正、負貢獻SNPs.度變化量增加最大的是節(jié)點39,增加值的大小是5,同理,減少量最大的是16,41,減少值的大小是2.

當(dāng)閾值為0.28時,對照組網(wǎng)絡(luò)中的平均度大致等于2,從而可以得到,當(dāng)病例、對照組網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點度的變化值大于等于3時,其對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)影響較大.故可設(shè)?d=3,由此,我們可以獲得對網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有顯著影響4個SNPs,如表2,其中rs206081,rs9534318為預(yù)設(shè)致病SNPs.

表2 給定參數(shù)為3的條件下,部分結(jié)構(gòu)性關(guān)鍵SNPs的信息及度的變化量

4.3 參數(shù)評估

在查找“結(jié)構(gòu)性關(guān)鍵SNPs”時,我們需要從網(wǎng)絡(luò)平均度出發(fā),對選取網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵SNPs設(shè)置合適的差值參數(shù).如果選取的差值參數(shù)比較小,對SNPs選取限制比較寬泛,一些不相關(guān)的SNPs也會選取到SNPs集合內(nèi),從而導(dǎo)致假陽性.反之,如果選取過于嚴苛,反而會遺漏一些比較重要的節(jié)點,導(dǎo)致假陰性.

我們選取基因BRCA2,得到它在閾值為0.28時候的網(wǎng)絡(luò),如圖2所示.選擇不同的差值參數(shù),得到一系列不同的結(jié)構(gòu)性關(guān)鍵SNPs,如表3所示.

表3 不同參數(shù)r的取值下關(guān)鍵SNPs個數(shù)

當(dāng)互信息閾值設(shè)定為0.28時,網(wǎng)絡(luò)中度的最大變化量是5.當(dāng)r≥5時,所得的關(guān)鍵SNPs只有節(jié)點39,對網(wǎng)絡(luò)影響較大的節(jié)點25卻被忽略.當(dāng)r≤2時,所得的關(guān)鍵SNPs只有13個,這里面也包括了其中的非零點.

5 結(jié)論與分析

本文通過國際項目HapMap3中以及Hapgen2軟件生成的13號染色體上BRCA2基因生成仿真數(shù)據(jù).利用互信息表示SNPs間的相互作用.構(gòu)建實驗組和對照組的網(wǎng)絡(luò),根據(jù)閾值及差值參數(shù)篩選出關(guān)鍵SNPs.最后,對我們所選擇的參數(shù)進行了評估,證明我們所選定的參數(shù)能夠反映結(jié)構(gòu)的變化,能夠較好地選擇出預(yù)設(shè)的關(guān)鍵SNPs.通過數(shù)值實驗發(fā)現(xiàn):樣本數(shù)目會影響互信息的大小,樣本數(shù)較小時,互信息較高,樣本數(shù)較大時,互信息逐漸降低,本文認為,樣本數(shù)偏少,則特異性個體數(shù)目不完備,樣本數(shù)過多,又會造成冗余,增加了計算復(fù)雜度.目前,確定合適的上下界仍然是一個具有挑戰(zhàn)的問題.

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