秦康樂(lè)　郭海燕　李擁軍

摘要：以江蘇省本地白山羊羔羊?yàn)橹饕芯繉?duì)象，經(jīng)羔羊屠宰場(chǎng)取卵后進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，在成熟培養(yǎng)液里添加不同濃度的促卵泡激素（FSH）和促黃體生成素（LH），探討FSH和LH對(duì)卵母細(xì)胞成熟率的影響。并對(duì)比羔羊與母羊的后期胚胎發(fā)育能力，以探究卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控機(jī)制。在成熟液里添加濃度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL 的FSH+LH，成熟培養(yǎng)后，其結(jié)果顯示成熟液中添加不同濃度FSH和LH對(duì)卵母細(xì)胞成熟率有顯著影響。其中成熟液中添加5.0 μg/mL FSH和LH濃度的羔羊卵母細(xì)胞成熟率明顯高于其他4組；成熟液中添加10.0 μg/mL FSH和LH濃度的成年母羊卵母細(xì)胞成熟率明顯高于其他4組；且羔羊和成年母羊卵母細(xì)胞在相同濃度成熟液中培養(yǎng)的效果無(wú)明顯差異（P>0.05）。

關(guān)鍵詞：羔羊；卵母細(xì)胞；體外成熟；促卵泡激素（FSH）；促黃體生成素（LH）

中圖分類(lèi)號(hào)： S826.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）15-0147-03

卵母細(xì)胞的成熟包括核、胞質(zhì)以及尚在研究中的分子成熟。核成熟的標(biāo)準(zhǔn)是卵母細(xì)胞是否排出第一極體[1-2]；細(xì)胞質(zhì)成熟在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程沒(méi)有明確的標(biāo)準(zhǔn)，但研究者在試驗(yàn)過(guò)程中通常把顆粒細(xì)胞擴(kuò)散程度、第一極體排除及卵周隙增加情況等作為評(píng)價(jià)胞質(zhì)成熟的指標(biāo)[3]；大量研究表明，盡管生長(zhǎng)完全的卵母細(xì)胞能夠經(jīng)歷正常的減數(shù)分裂和胞質(zhì)成熟，但僅有小部分能夠發(fā)育至囊胚階段[4]，而且通過(guò)觀(guān)測(cè)超微結(jié)構(gòu)的變化難以評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞間發(fā)育能力的差異，為此一些學(xué)者提出分子成熟的推測(cè)，即卵母細(xì)胞排卵前在母體內(nèi)積累了大量的母源mRNA和蛋白質(zhì)，獲得了接下來(lái)受精后發(fā)育至胚胎的能力，也稱(chēng)“卵母細(xì)胞的獲能”[5]。只有在卵母細(xì)胞核、胞質(zhì)以及分子都成熟的條件下，才能進(jìn)行正常的受精、受精卵分裂以及最終發(fā)育成囊胚。不過(guò)，研究者在實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程中，常以卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展程度以及第一極體的排出作為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)準(zhǔn)[6]。

卵母細(xì)胞成熟是一個(gè)伴隨著各種生理生化反應(yīng)、復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中很多因素影響其最終結(jié)果。經(jīng)前人多年研究，培養(yǎng)液、空氣成分、溫度、濕度、pH值、時(shí)間控制等因素都有了明確的參考，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系也已經(jīng)形成并成效顯著，但是卵母細(xì)胞體外成熟后的發(fā)育能力仍不如體內(nèi)成熟后的發(fā)育能力[7]。作為幼畜體外胚胎生產(chǎn)和移植技術(shù)的重要內(nèi)容，卵母細(xì)胞體外成熟是體外受精和體外胚胎培養(yǎng)的重要基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，對(duì)揭示卵母細(xì)胞的成熟機(jī)理具有重要意義，為胚胎工程的研究提供了大量的試驗(yàn)材料。

而激素作為哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟的基礎(chǔ)調(diào)節(jié)物，在卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。FSH和LH是卵母細(xì)胞體外成熟液中最常用的2種促性腺激素，此外還有雌二醇E2和孕馬血清促性腺激素PMSG也可在體外促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。大量研究表明，F(xiàn)SH和LH在體外成熟培養(yǎng)中，協(xié)同促進(jìn)成熟且在成熟液濃度相等時(shí)效果最好，但是不同研究得出的最佳濃度并不一樣，這與山羊品種、季節(jié)和地域等因素息息相關(guān)。因此，本研究通過(guò)在卵母細(xì)胞成熟液中添加不同濃度FSH和LH，分別研究FSH和LH對(duì)羔羊以及成年母羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響，并對(duì)兩者進(jìn)行對(duì)比研究，以期完善羔羊卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)，提高羔羊卵母細(xì)胞的成熟效果，為后續(xù)的胚胎試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），購(gòu)自GIBCO公司；透明質(zhì)酸酶，購(gòu)自Solarbio公司；FSH、LH、雌二醇（E2），購(gòu)自Bioniche公司；HEPES、BSA（bovine serum albumin），購(gòu)自Genyiew公司；礦物油（mineral oil），購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。

成熟基礎(chǔ)液配制：TCM199，NaHCO3 2.2 g/L，丙酮酸鈉25.0 mg/L，HEPES 4.8 g/L，青霉素鈉和硫酸鏈霉素各 100 IU/mL。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)分組試驗(yàn)分為5組，在成熟基礎(chǔ)液中分別添加不同劑量的激素（表1）。

1.2.2卵巢的采集

本試驗(yàn)在江蘇省南通市海安縣山羊交易市場(chǎng)采集樣本。選擇江蘇本地白山羊品種、健康的1～2年齡成年母羊和2月齡羔羊進(jìn)行試驗(yàn)，在屠宰過(guò)程中獲取其新鮮的卵巢，裝入樣品袋，編號(hào)后放置于冰塊上，2～4 h內(nèi)運(yùn)回試驗(yàn)室。

1.2.3卵母細(xì)胞的收集

卵巢運(yùn)回試驗(yàn)室后，用手術(shù)剪刀快速去除其表面多余組織，用38.5 ℃的卵巢洗滌液清洗3次后放入裝有PBS的培養(yǎng)皿中。把培養(yǎng)皿放置于39 ℃的溫控板上，挑選表面直徑為1～5 mm的卵泡，用無(wú)菌鑷子固定卵巢，用手術(shù)刀輕輕劃破卵泡，再用注射器吸取PBS沖洗劃破的卵泡，匯集沖洗液，靜置1 min后在體視顯微鏡下檢卵，用口吸管挑選出形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻且包有1層以上完整卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），隨機(jī)分組進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

1.2.4卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)

成熟培養(yǎng)采用微滴培養(yǎng)法，微滴上覆蓋石蠟油。本試驗(yàn)選用35 mm直徑的培養(yǎng)皿，可放置4個(gè)微滴，每個(gè)微滴50 μL成熟液。把挑選好的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體用口吸管移入平衡2 h之后的微滴中洗滌3次，放置在最后1個(gè)微滴中。最后把各試驗(yàn)組培養(yǎng)皿移入38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～26 h，羔羊則為22～24 h。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)可先通過(guò)觀(guān)察卵丘顆粒細(xì)胞的擴(kuò)散狀況來(lái)初步判斷卵母細(xì)胞整體成熟效果是否良好，然后把卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體放入透明質(zhì)酸酶溶液微滴里，用槍頭快速吹打以剝離顆粒細(xì)胞，收集卵母細(xì)胞裸卵，并在倒置顯微鏡下觀(guān)察是否成熟，以細(xì)胞分出第一極體為成熟標(biāo)準(zhǔn)（圖1）。

[TPQKL1.tif；S+4mm]

1.3數(shù)據(jù)處理endprint

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件中單因子分析和獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<005表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度FSH和LH對(duì)成年母羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

成年母羊卵母細(xì)胞體外成熟率見(jiàn)表2。

3討論與結(jié)論

3.1激素對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟效果的影響

FSH可以誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，這是卵母細(xì)胞成熟的前提條件。FSH能促進(jìn)卵丘細(xì)胞增生分化、向外擴(kuò)展并刺激卵丘細(xì)胞產(chǎn)生一種能促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的細(xì)胞因子[8]。FSH還可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌雌激素，間接調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟[9]。有研究表明，F(xiàn)SH能維持顆粒細(xì)胞內(nèi)高水平的cAMP，從而抑制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂即成熟，使核成熟的同時(shí)胞質(zhì)也能充分成熟，提高了卵母細(xì)胞的成熟率及后期胚胎發(fā)育潛力。但有人認(rèn)為，促性腺激素抑制卵母細(xì)胞的成熟，F(xiàn)SH不僅抑制胞質(zhì)和細(xì)胞核的成熟，而且對(duì)減數(shù)分裂紡綞體有損害[9]。由此可見(jiàn)，F(xiàn)SH對(duì)卵母細(xì)胞成熟的具體影響還沒(méi)有研究透徹。

在動(dòng)物體內(nèi)，F(xiàn)SH可以與顆粒細(xì)胞表面的受體結(jié)合，分泌雌二醇，誘導(dǎo)卵泡膜上LH受體的生成，濾泡細(xì)胞表面FSH受體數(shù)目增加，隨著雌二醇濃度的不斷升高而分泌LH。LH濃度積累形成LH峰，使經(jīng)卵丘細(xì)胞運(yùn)輸?shù)铰涯讣?xì)胞并抑制卵母細(xì)胞成熟的物質(zhì)如cAMP減少，激發(fā)卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂的啟動(dòng)一直到成熟排出第一極體[10]。由此可見(jiàn)，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，F(xiàn)SH、LH、E2等多種激素參與了調(diào)控。因此，在體外培養(yǎng)時(shí)，多種激素協(xié)同作用提高卵母細(xì)胞成熟率還需要繼續(xù)深入研究。

3.2羔羊與成年母羊卵母細(xì)胞成熟率的差異

本試驗(yàn)中，羔羊卵母細(xì)胞成熟率與成年母羊卵母細(xì)胞成熟率并無(wú)顯著差異，這與Ledda等的研究[11]一致。只是此成熟率表示的是出現(xiàn)第一極體（核成熟）的概率，卵母細(xì)胞的胞質(zhì)并不一定完全成熟，而且羔羊卵母細(xì)胞的胞質(zhì)容易產(chǎn)生成熟不完全或紊亂，對(duì)后期胚胎發(fā)育影響巨大。由試驗(yàn)結(jié)果可知，成年母羊卵母細(xì)胞在FSH和LH濃度都為10.0 μg/mL的成熟液中培養(yǎng)時(shí)，成熟率最高；而羔羊在FSH和LH濃度都為 5.0 μg/mL 的成熟液中培養(yǎng)時(shí)，成熟率最高。羔羊所需激素濃度與成年羊不一樣，這可能是由于羔羊?qū)に孛舾卸雀呒醇に貞?yīng)答能力強(qiáng)，可以用少量的激素發(fā)揮出與成年母羊一樣的成熟效果；也可能是由于幼齡動(dòng)物的卵母細(xì)胞在形態(tài)、代謝和超微結(jié)構(gòu)等方面與成年動(dòng)物的卵母細(xì)胞有所不同[12]，羔羊?qū)に氐拇x速度慢，更多的激素積聚在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與受體結(jié)合發(fā)揮作用。但是造成這種差別的確切機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

3.3結(jié)論

羔羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)時(shí)，在成熟液中添加濃度為 5.0 μg/mL 的FSH和LH，成熟率明顯提高；成年母羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)時(shí)，在成熟液中添加濃度為10.0 μg/mL的FSH和LH，成熟率明顯提高；而且羔羊和成年母羊卵母細(xì)胞在相同成熟液中培養(yǎng)的效果無(wú)明顯差異（P>0.05）。

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