林峰　宋歡　黃承俊

摘要：為了提高奶牛體外受精效果，研究了體外成熟卵母細胞在IVF-100、BO、TALP 3種體外受精液中的受精效果，同時比較了裸卵（NOs）與卵丘卵母細胞復合體（COCs）對受精效果的影響。結果顯示，體外成熟卵母細胞在受精液IVF-100中的卵裂率顯著高于BO液（P<0.05），而TALP液中的卵裂率與IVF-100和BO液的差異都不顯著（P>0.05）；裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母細胞復合體（COCs），但差異不顯著（P>0.05）；NOs的囊胚率極顯著低于COCs（P<0.01）。不同受精液及有無卵丘細胞對卵母細胞的體外受精效果有明顯的影響。

關鍵詞：奶牛；卵母細胞；體外受精；卵裂率；囊胚率

中圖分類號： S823.9+13文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0137-02

隨著配子與胚胎生物技術的研究與應用，對胚胎的需求量越來越大。超數(shù)排卵和胚胎移植的合理化應用雖能成倍提高優(yōu)良母畜的繁殖率，但所獲得的胚胎數(shù)量有限。為了解決這個問題，近年來國內外對奶牛卵母細胞體外受精技術進行了大量的研究。保國俊等通過體外受精技術提供了更多數(shù)量、更低成本的胚胎[1-2]，IVF技術是對品種優(yōu)良的公畜、母畜發(fā)揮出超常繁殖能力的一種應用。

由于體外受精技術操作環(huán)節(jié)十分復雜，影響結果因素較多，且卵母細胞在體外的生長繁殖對生存環(huán)境要求特別高，易導致試驗體系不夠穩(wěn)定，從而對試驗結果的準確性造成很大影響[3-4]。本研究通過對比3種受精液對卵母細胞體外受精效果的研究，以其為基礎來研制出更好的受精液，進而加快我國奶牛業(yè)的發(fā)展，提高經(jīng)濟效益。裸卵和卵丘卵母細胞體外受精后，都可以發(fā)育到囊胚階段，但裸卵的囊胚率顯著低于卵丘卵母細胞的囊胚率。通過對比2種卵母細胞的囊胚率，對體外受精時卵母細胞的篩選起著重要作用。本試驗就不同受精液、不同形態(tài)的卵子對奶牛成熟卵母細胞體外受精能力的影響進行了研究，皆在為優(yōu)化奶牛體外受精提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1卵巢的采集與保存

本試驗所用奶牛卵巢來自河南省鄭州市郊個體屠宰場。屠宰后立即采集卵巢并除去多余的脂肪組織，然后用加有雙抗的生理鹽水沖洗5～6次，保存在裝有37 ℃左右、加有雙抗的滅菌生理鹽水中，于2～3 h內帶回實驗室。

1.1.2主要試劑

胎牛血清（FBS）（Biotech，P40-47500）；肝素鈉（Sigma，H3149-25KU）；石蠟油（Sigma）；TCM-199（Gibco）；NaCl（Sigma，S-5886）；KCl（Sigma，P-5405）；NaH2CO3（Sigma，S-5761）；NaH2PO4（Sigma，RDD007）；CaCl2·2H2O（Sigma，C-5080）。

1.2試驗方法

抽吸法：用無菌紗布將卵巢表面擦干，抽吸法吸取直徑 2～8 mm的卵泡，抽吸液注入培養(yǎng)皿中，挑選裸卵、半裸卵及具有3層及其以上卵丘的卵丘-卵母細胞復合體（cumulus oocyte complexes，COCs）用于試驗。

1.3卵母細胞分級標準

根據(jù)包被卵母細胞的卵丘細胞完整性、卵丘細胞層數(shù)以及卵母細胞的胞質均勻性將卵母細胞分為4級：A級，卵丘細胞3層以上，胞質均勻；B級，1～2層卵丘細胞，胞質均勻；C級，裸卵，卵丘細胞不完整；D級是死亡或退化的卵母細胞。A、B級卵母細胞為可用卵母細胞。

1.4卵母細胞體外成熟培養(yǎng)

將收集的卵母細胞用成熟液洗3遍，然后每40～60個移入平衡至少2 h的1 mL成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空氣、38.5 ℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)23～24 h。若卵丘細胞共培養(yǎng)則用微滴法（100 μL），以排出第一極體為卵母細胞成熟的標志[5]。

1.5卵母細胞的體外受精

受精液為IVF-100或BO液時運用直接離心法對精子進行洗滌，即用6 mL洗精液稀釋解凍的精液并于2 000 r/min下離心7 min，棄去上清液，重復1次后用受精液稀釋精子，密度為1×106～6×106 個/mL，然后放入CO2培養(yǎng)箱中備用。受精液為TALP液時則用上浮法對精子進行30～60 min的孵化，然后再離心洗滌。將23～24 h成熟的卵母細胞于受精液中洗3遍，并用1 mL移液管將卵丘細胞部分去除。每10枚左右卵子移入平衡2 h的覆有石蠟油的50 μL受精微滴中，加入50 μL精液后于CO2培養(yǎng)箱中進行受精。IVF-100受精時間為6 h，BO液受精時間為8 h，TALP液受精時間為18 h。

1.6卵母細胞體外成熟判定

卵丘-卵母細胞成熟培養(yǎng)22～24 h后，主要通過在顯微鏡下觀察卵母細胞的形態(tài)來判斷卵母細胞是否成熟。正常成熟的卵母細胞細胞質均勻，沒有空泡，其周圍的卵丘細胞發(fā)生擴展。卵丘細胞擴展常用作判斷卵母細胞體外成熟的特征。將培養(yǎng)成熟的卵母細胞放入含有0.1%透明質酸酶的成熟培養(yǎng)液中，在CO2培養(yǎng)箱中孵育10 min后用吸胚管輕輕吹打以脫去卵丘細胞，將裸卵在體視顯微鏡下鏡檢，含有第一極體的判為成熟[6]。若卵周隙明顯變大，細胞質中有空泡出現(xiàn)，判定已經(jīng)開始退化。

1.7統(tǒng)計分析

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的整理與分析。

2結果與分析

2.1不同受精液對受精卵卵裂的效果

將經(jīng)體外成熟的卵母細胞隨機移入3種不同的受精微滴（即TVF-100、BO液和TALP液）中受精。受精后進行胚胎的體外培養(yǎng)，從受精開始算起48 h對各組的卵裂情況進行統(tǒng)計分析。從表1可以看出，用IVF-100作為受精液，其體外受精48 h后的卵裂率顯著高于BO液的卵裂率（P<0.05），而以TALP液作為受精液，其卵裂率與其他組無差異。說明不同的受精液對卵裂有顯著影響，從卵母細胞卵裂率來看，IVF-100作為受精液顯著優(yōu)于BO液和TALP液2種受精液。endprint

2.2卵丘細胞對卵母細胞受精及受精后胚胎體外發(fā)育的效果

選取成熟的裸卵（NOs）和成熟的卵丘卵母細胞（COCs）進行體外受精，并用IVF-100受精液稀釋精子，受精后進行胚胎的體外培養(yǎng)，從受精開始算起48 h對各組的卵裂情況進行統(tǒng)計分析。從表2可以看出，雖然COCs的卵裂率高于自然裸卵，但差異并不顯著（P>0.05），而其囊胚率極顯著高于COCs的（P<0.01）。表明卵丘細胞對卵母細胞受精后體外發(fā)育的影響要遠高于對卵母細胞受精的影響。

3討論

3.1不同受精液對奶牛卵母細胞體外受精的影響

影響卵母細胞體外受精的因素很多[6]，受精液及其成分以及卵母細胞的形態(tài)是主要因素。本試驗對比了3種不同的受精液對卵母細胞體外受精效果的影響，BO液和TALP液為目前經(jīng)典的2種受精液，這些溶液相對比較簡單，主要成分是無機鹽離子，不含復雜的氨基酸和維生素等成分。IVF-100為商品化的受精液，基礎液為BO液，效果穩(wěn)定而且效率較高，對于成熟良好的卵母細胞受精率一般高達80%～90%。由于其價格較高，常用于活體取得的卵子體外受精或其他特殊卵子的體外受精試驗中[7]。試驗結果顯示，IVF-100作為受精液時的卵裂率顯著高于BO液的（P<0.05），雖然在數(shù)值上表現(xiàn)出高于TALP液的趨勢，但統(tǒng)計檢驗差異不顯著。同時TALP液與BO液的卵裂率也無明顯差異。不同受精液對試驗結果有著明顯的影響。這表明IVF-100在促進受精卵的卵裂上的作用要強于BO液，同時也說明BO液作為體外受精液還存在巨大的改進空間。BO液對精子的作用比較強烈，因而與受精卵共孵化的時間不能過長。相比之下TALP液對精子的作用就比較溫和些，與本試驗結果相同，許多試驗顯示其雖然在數(shù)值上有高于BO液的趨勢但統(tǒng)計結果無差異。而且一些試驗結果表明其對胚胎發(fā)育效果不如BO液[8-9]，由于這方面受受精時間、卵丘細胞、精子的洗滌等許多因素的制約，其機制仍有待探索。就總體而言，成熟良好的卵母細胞不管用于何種受精液，其受精卵的卵裂率都較高，但IVF-100對受精卵卵裂的促進作用要強于其他受精液。IVP技術作為一個整體，各個環(huán)節(jié)精密相關，因而要想得到較多的可移植胚，一個相對較好的受精環(huán)節(jié)是必須的。

3.2有無卵丘細胞對卵母細胞體外受精效果的影響

本研究在自然裸卵與COCs經(jīng)體外成熟后，對其體外受精的卵裂率及囊胚發(fā)育率進行了比較。結果顯示，自然裸卵的卵裂率顯著低于COCs的，并且囊胚發(fā)育率的差異達到了極顯著水平。李榮鳳等試驗結果也表明，個別自然裸卵是能夠發(fā)育到囊胚的[10]。Yang等研究表明，卵母細胞成熟過程中的許多機制都需要通過卵丘細胞來完成，自然裸卵經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后雖然部分能排出第一極體，但沒有繼續(xù)發(fā)育的潛力[11]。本研究并不排除個別特殊卵母細胞的存在，但其原因仍有待進一步探索。

4結論

體外成熟卵母細胞在受精液IVF-100中的卵裂率優(yōu)于BO液與TALP液。裸卵（NOs）的卵裂率低于卵丘卵母細胞復合體（COCs），但差異不顯著；NOs能夠發(fā)育到囊胚階段，但囊胚率極顯著低于COCs的。

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