楊佳棟　劉月琴　張英杰

摘要：為更好地認(rèn)識哺乳動物GDF9基因在長期進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境形成的密碼子使用模式，通過CodonW軟件計(jì)算不同哺乳動物GDF9基因的密碼子偏性指標(biāo)，利用SPSS軟件對密碼子偏好性影響因素的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)合密碼子偏性和最小進(jìn)化法分析其親緣關(guān)系。GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT為哺乳動物GDF9基因的最優(yōu)密碼子，該基因偏愛使用以A或T結(jié)尾的密碼子；G、C含量和蛋白質(zhì)親水性是影響GDF9基因密碼子偏性的主要因素；聚類分析提示不同哺乳動物間的同源性越高，GDF9基因密碼子使用特征的相似性越高。

關(guān)鍵詞：哺乳動物；GDF9；堿基替換；密碼子偏性；聚類分析

中圖分類號： Q755文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0041-05

在雌性哺乳動物整個生殖周期過程中，卵母細(xì)胞只能來源于原始卵泡庫[1]。有研究表明，原始卵泡形成過程受激素、轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)通路的介導(dǎo)[2]。生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）作為轉(zhuǎn)化生長因子β超家族成員之一，在卵泡的發(fā)育過程中有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[3]。密碼子是DNA或RNA的堿基序列與其編碼蛋白序列之間的對應(yīng)關(guān)系[4]。編碼相同氨基酸的密碼子為同義密碼子，在蛋白合成過程中，同義密碼子的使用頻率存在差異，且物種和基因?qū)δ骋环N或幾種密碼子的使用具有偏好性[5]。對基因密碼子偏好參數(shù)進(jìn)行分析，能更好地理解和研究基因水平轉(zhuǎn)移和基因家族分化的發(fā)生[6]。因此對密碼子偏好性的研究可在分子的角度為GDF9基因序列特征、分類和遺傳進(jìn)化規(guī)律提供重要信息。前人相關(guān)研究表明，GDF9基因具有刺激顆粒細(xì)胞減數(shù)分裂、抑制素的生成作用[7]，并影響卵泡發(fā)育和生殖功能[8]。Wang等發(fā)現(xiàn)通過siRNA敲除GDF9后能抑制倉鼠原始卵泡的形成，但添加GDF9純品培養(yǎng)卵巢會加速原始卵泡的形成[9]。在人、嚙齒類、牛、綿羊和有袋類動物卵巢卵母細(xì)胞中，GDF9基因特異性表達(dá)，但該基因在山羊卵母細(xì)胞和黃體中可同時表達(dá)[10-11]。GDF9基因還能通過多個信號通路促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖過程[12]。馬會明等通過RNA干擾使該基因表達(dá)沉默，也能抑制顆粒細(xì)胞增殖過程[13]。這些研究通過探討不同哺乳動物已被克隆的GDF9基因，并在卵巢卵母細(xì)胞中進(jìn)行了相關(guān)表達(dá)分析，但未開展密碼子使用偏性的研究，這不利于其異源表達(dá)和遺傳轉(zhuǎn)化等后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。GDF9基因密碼子使用偏好性的研究能為該基因的分類和進(jìn)化提供重要信息。本研究利用CodonW軟件分析不同哺乳動物GDF9基因?qū)γ艽a子的使用情況，基于GDF9基因最小進(jìn)化法和同義密碼子相對使用度的歐式平方距離系數(shù)建立聚類關(guān)系，為GDF9基因功能的深入研究提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1目的基因的來源

本研究所用基因資料都來源于Nucleotide（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）數(shù)據(jù)庫，12種物種包括靈長目蘇門答臘猩猩、普通狨猴和人，食肉目家貓和家犬，偶蹄目家牛、牦牛、綿羊、山羊和野豬，嚙齒目小家鼠和褐家鼠。各哺乳動物GDF9都是完整的cDNA序列（表1）。利用MEGA 6.0對上述核苷酸序列進(jìn)行堿基分析。

1.2目的基因的篩選

對候選的哺乳動物GDF9基因cDNA序列進(jìn)行如下規(guī)則的篩選：（1）cDNA序列為完整編碼蛋白序列；（2）該cDNA序列長度>300 bp；（3）蛋白翻譯部位位于細(xì)胞質(zhì)；（4）質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子及病毒上的基因不予考慮；（5）多拷貝基因不重復(fù)計(jì)算。

1.3相關(guān)密碼子偏性分析指標(biāo)

通過CodonW軟件來分析GDF9基因密碼子使用偏性，分析數(shù)值包括有效密碼子數(shù)（effective number of codons，ENc）、密碼子偏愛指數(shù)（condon bias index，CBI）、同義密碼子相對使用度（relative synonymous codon usage，RSCU）；同時通過該軟件來分析GDF9基因密碼子偏性的影響因素，即GC含量（GC）、密碼子第3位的GC含量（GC3s）、芳香族氨基酸比例（aromatic amino acid ratio）、蛋白質(zhì)親水性（protein hydrophilicity）的相關(guān)性。

1.4堿基替代飽和度檢驗(yàn)

利用BioEdit軟件對不同哺乳動物GDF9基因的cDNA序列進(jìn)行比對，將比對結(jié)果保存為fasta格式，通過DAMBE軟件對比對結(jié)果的堿基替代飽和度進(jìn)行檢驗(yàn)，若轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)沒有達(dá)到飽和，可進(jìn)行下一步的系統(tǒng)發(fā)育分析，反之亦然。

1.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

通過CodonW軟件計(jì)算出不同哺乳動物GDF9基因的RSCU值，利用SPSS多元分析軟件計(jì)算其相應(yīng)的歐氏平方距離，并進(jìn)行系統(tǒng)聚類。通過MEGA軟件中最小進(jìn)化法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1不同物種GDF9基因序列堿基特征

由表1可知，在12種物種中，靈長目蘇門答臘猩猩和人cDNA序列長度最短，但與普通狨猴差別較大，相差250 bp。偶蹄目家牛、牦牛和綿羊cDNA序列最長，但野豬cDNA序列短27 bp，這可能與單胃和反芻動物分類有關(guān)。在ATCG堿基分布中，除小家鼠（A+T=45.9%）、野豬（A+T=49.8%）和褐家鼠（A+T=47.2%）外，其余物種A+T堿基含量高于 G+C 堿基含量，表明GDF9基因更傾向于使用A或T堿基。

2.2密碼子使用偏性分析

ENc能反映密碼子使用頻率和同義密碼子平均使用頻率的偏差。ENc越小，偏好性越強(qiáng)，即高表達(dá)基因易于使用一種或幾種同義密碼子，反之亦然，即低表達(dá)基因所包含的稀有密碼子種類越多[14-15]。由表1可知，除家貓之外，其余11種哺乳動物的有效密碼子數(shù)均小于55，表明GDF9基因?qū)νx密碼子使用存在一定的偏好性。但各哺乳動物的GC3s值與其G+C堿基含量有差異。當(dāng)CBI>0時，即在0～1范圍之間；越接近0，表示該基因?qū)γ艽a子使用為完全隨機(jī)，不存在偏性，反之亦然。本研究所用物種的密碼子偏愛指數(shù)均>0，其中家牛和牦牛的CBI值最小，均為0.024，小家鼠的CBI值最大，為0.107，但該值也遠(yuǎn)離1，表明不同哺乳動物GDF9基因?qū)γ艽a子的使用不存在絕對的偏好性。endprint

RSCU值的大小能反映同義密碼子家族的密碼子使用偏移情況，當(dāng)RSCU=1時，表明密碼子使用沒有偏性；當(dāng) RSCU>1 時，表明此密碼子使用頻率較高[16]。由表2可知，RSCU>1.5的密碼子有25個，其中以GCT、TGT、TTT、GGG、ATT、CTG、CCT、CAG、AGA、AGG、ACT、ACC和CTG密碼子的使用頻率較高，同時可得出GDF9基因偏好使用A或T結(jié)尾的密碼子。

2.3密碼子使用偏性的影響因素分析

由表3可知，GC、GC3s和Aromo都與CBI呈正相關(guān)，其中GC與CBI呈顯著正相關(guān)，Gravy與CBI呈負(fù)相關(guān)；GC、GC3s和Gravy都與ENc呈負(fù)相關(guān)，其中Gravy與ENc呈顯著負(fù)相關(guān)，Aromo與ENc呈正相關(guān)。上述結(jié)果表明，GC含量和蛋白質(zhì)親水性對GDF9基因密碼子偏性有影響。

2.4不同物種GDF9基因的堿基替代飽和度檢驗(yàn)

圖1橫坐標(biāo)代表核苷酸轉(zhuǎn)換數(shù)（s）和核苷酸顛換數(shù)（v），縱坐標(biāo)代表基于F84模型建立的遺傳距離。GDF9基因的核苷酸轉(zhuǎn)換數(shù)和顛換數(shù)均隨著遺傳距離的增加而變大，且兩者呈線性增加關(guān)系，表明本研究所用的12種哺乳動物GDF9基因序列堿基替代未達(dá)到飽和，可進(jìn)行下一步的聚類分析。

2.5GDF9基因的聚類分析

由圖2可知，12種哺乳動物共分為三大類：一類是偶蹄目家牛、牦牛、綿羊、山羊和野豬；一類是靈長目蘇門答臘猩猩、人、普通狨猴和食肉目家貓、家犬；另一類是嚙齒目小家鼠和褐家鼠，其中靈長目和食肉目的親緣關(guān)系較近，而偶蹄目、靈長目、食肉目與嚙齒目的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其中類間的最大距離標(biāo)準(zhǔn)化是25。由圖3可知，偶蹄目和食肉目親緣關(guān)系較近，二者與靈長目親緣關(guān)系較近，嚙齒目與其親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。2種不同方法構(gòu)建的聚類結(jié)果不一致，但結(jié)合其密碼子偏性指標(biāo)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系較近的物種，其密碼子使用偏好性一致。

3討論

密碼子偏好性的研究對了解物種起源于進(jìn)化、目的基因的改造、 推測未知基因表達(dá)水平及預(yù)測目的基因最佳宿主奠定了理論基礎(chǔ)[17-18]，同時為轉(zhuǎn)基因研究中的甲基化能否引起基因表達(dá)量下降或基因沉默提供參考[19]。本研究所選12種哺乳動物GDF9基因的有效密碼子數(shù)值在49.57～53.42區(qū)間波動，密碼子使用上存在一定的偏好性；在堿基序列組成成分上，9種哺乳動物的AT含量高于GC含量，但密碼子第3位的GC含量（GC3s）與GC含量存在差異；12種哺乳動物有25個密碼子的同義密碼子相對使用度>1.5，其中以GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT為主，說明GDF9基因偏好使用A或T結(jié)尾的密碼子。因此推斷堿基組成是造成密碼子偏好性的原因之一，這與姜艷等的研究結(jié)果[20]一致。

目前的研究認(rèn)為，堿基差異（突變）、自然選擇、cDNA序列長度和tRNA豐度對密碼子偏好性均有影響[21]。Chen等發(fā)現(xiàn)自然選擇造成的密碼子變化可能提高基因表達(dá)效率和多肽折疊動力，但這只發(fā)生在特定的基因中，甚至在特定基因的特定位置中[22]。本研究選取不同哺乳動物相同基因，可忽略蛋白自然選擇和tRNA豐度等影響，通過分析密碼子使用偏性的影響因素，發(fā)現(xiàn)GC含量和蛋白質(zhì)親水性是影響GDF9基因密碼子偏性的主要因素。已有研究表明，GC含量對同義密碼子使用偏好性有重要影響，密碼子偏好性越強(qiáng)的基因越趨向于使用以G或C結(jié)尾的密碼子，且密碼子偏好性的變化往往由第3位密碼子決定[23]。因子在不存在自然選擇壓力的情況下，一定方向的突變壓力對第3位堿基種類會有影響[24]。

本研究基于密碼子使用偏性的聚類與基于最小進(jìn)化法形成的聚類相比，發(fā)現(xiàn)同一目下的物種聚為一類，即親緣關(guān)系較近。但2種聚類結(jié)果存在差異，主要集中在前者將靈長目和食肉目聚為一類，后者將偶蹄目和食肉目聚為一類。這種聚類結(jié)果不一致的現(xiàn)象在植物和其他動物[25-28]中均出現(xiàn)過，提示我們在今后的研究中，對物種的分離不能僅局限于對堿基組成的分析。可結(jié)合密碼子使用偏性和編碼區(qū)序列總和的結(jié)果進(jìn)行分析，這樣可為提高分類結(jié)果準(zhǔn)確度提供重要參考。GDF9基因偏好使用的密碼子的確定有利于其轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)的建立，并對其目的基因的改造和最優(yōu)密碼子的優(yōu)化等提供理論基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本研究通過分析12種哺乳動物GDF9基因密碼子使用模式，發(fā)現(xiàn)不同哺乳動物間密碼子選擇偏性具有差異性，確定該基因的最優(yōu)密碼子為GCT、TGT、TTT、ATT、CCT、AGA、ACT，且偏愛使用A或T結(jié)尾的密碼子。GC含量和蛋白質(zhì)親水性是影響GDF9基因密碼子偏性的主要因素?；诿艽a子使用偏性的聚類與基于最小進(jìn)化法形成的聚類均表明親緣關(guān)系相近的物種間的密碼子使用特征較為一致，但2種方法構(gòu)建的聚類結(jié)果存在差異。

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