劉曉慧　劉毅

[摘要]脂肪組織工程中構建的組織塊體積較小，主要與所構建的脂肪組織中新生血管生成不充分有關。脂肪組織是人體組織中血管分布最豐富的組織，每一個脂肪細胞都被豐富的毛細血管網(wǎng)所圍繞，因此如何有效構建血管化組織工程脂肪成為再生醫(yī)學的熱點問題。脂肪組織工程三要素：種子細胞；與種子細胞具有良好生物相容性的三維支架和調(diào)控脂肪組織生長的微環(huán)境。本文擬就調(diào)控脂肪組織生長的微環(huán)境來分析影響構建血管化組織工程脂肪的因素。

[關鍵詞]脂肪組織工程；脂肪組織；組織工程微環(huán)境；血管化；細胞因子

[中圖分類號]R622 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）06-0129-04

脂肪組織工程中修復軟組織缺損時，構建出的脂肪組織體積往往較小，主要與所構建的脂肪組織中新生血管生成不充分有關。而脂肪組織中每一個脂肪細胞都被豐富的毛細血管網(wǎng)所圍繞，是人體中血管分布最豐富的組織，在再生醫(yī)學領域，如何構建血管化組織工程脂肪成為一大難題。脂肪組織工程具有三要素：種子細胞；與種子細胞具有良好生物相容性的三維支架和調(diào)控脂肪組織生長的微環(huán)境；每一個要素都直接影響血管化組織工程脂肪的形成。本文擬就調(diào)控脂肪組織生長的微環(huán)境來分析影響構建血管化組織工程脂肪的因素。

1組織工程脂肪的血管生成

脂肪組織工程中脂肪組織血管的生成主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞的增殖及遷移，通過細胞間連接進而形成管腔，在血管周圍支持細胞協(xié)同下，與現(xiàn)有的血管吻合，從而形成循環(huán)。脂肪組織中脂肪干細胞、前脂肪細胞、脂肪細胞以及炎性細胞可通過旁分泌作用，分泌各種細胞因子促進血管的形成。白色和棕色脂肪組織均可產(chǎn)生多種促血管生成生長因子，包括血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A），肝細胞生長因子（HGF），酸性和堿性成纖維細胞生長因子（aFGF/bFGF），瘦素等以及抗血管生成因子，包括血小板反應蛋白-1（TSP-1）或其他血管生成調(diào)節(jié)劑如纖溶酶原激活物抑制劑或脂聯(lián)素，這些因子共同決定脂肪組織中生成的血管表型。巨噬細胞、其他炎性細胞和基質(zhì)細胞同樣參與血管生成的調(diào)節(jié)。

2促進血管生成的因素

2.1血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothel ial growthfactor，VEGF）：VEGF家族在脂肪組織工程微環(huán)境中與血管生成的關系最為密切，活性最強，是1989年Ferrara和Henze從牛垂體濾泡細胞體外培養(yǎng)液中首次分離純化出來的，主要由血管基質(zhì)成分及成熟的脂肪細胞表達。在所有的脂肪組織中，大網(wǎng)膜表達最高水平的VEGF。VEGF家族包括A、B、C、D、E、F以及胎盤生長因子（Placental growthfactor，PIGF），以不同的方式與三種酪氨酸激酶受體結合，即VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3。VEGF家族成員中主要發(fā)揮作用的是VEGF-A，許多研究表明，VEGF-A在生理性和病理性血管形成中至關重要。VEGF-A主要結合VEGFR1和VEGFR2，VEGFR1表達于血管內(nèi)皮細胞、周皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、胎盤滋養(yǎng)細胞和造血干細胞，誘導單核細胞、巨噬細胞增殖及血管的發(fā)生及生成。而VEGFR2主要表達于血管內(nèi)皮細胞，誘導血管的形成。VEGF-C和VEGF-D主要作用于VEGFR3，VEGFR3在發(fā)育期間存在于所有內(nèi)皮細胞，但在成體中局限于淋巴管及部分網(wǎng)狀血管內(nèi)皮表面，因此VEGF-CS和VEGF-D主要參與淋巴管的形成及細胞外基質(zhì)（EcM）的降解。胎盤生長因子（PIGF）僅在病理條件下作用于VEGFR1促進血管的生成?？烘玫葘y帶VEGF165基因的慢病毒轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細胞，VEGF呈持續(xù)表達，在Wistar大鼠體內(nèi)成功構建出組織工程脂肪；Zhang Q等將含有VEGF的PLGA/PEG微球包裹于接種脂肪干細胞的膠原殼聚糖支架中，并種植于裸鼠的體外組織工程室模型中，8周后相比較對照組，實驗組新生血管以及脂肪組織明顯增加。

2.2肝細胞生長因子（HGF）：HGF由間充質(zhì)產(chǎn)生，并且通過激活c-Met受體的酪氨酸磷酸化，刺激各器官中的上皮細胞進行有絲分裂，進而增殖、運動，導致人體形態(tài)的發(fā)生和血管生成。HGF/c-Met信號通路同時可協(xié)同VEGF/VEGFR信號通路參與血管生成的調(diào)節(jié)。研究表明與VEGF和bFGF不同的是，HGF在誘導成熟的血管形成的過程中，不激活NK-KB途徑，而NK-KB途徑激活引起炎癥，可導致血管通透性的升高，因此，HGF僅僅促進血管的生成，而不誘導炎癥的發(fā)生及血管通透性的增加。

2.3堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）：bFGF是由Gospodarowiz等于1974年在牛腦垂體中分離純化，bFGF可通過激活Akt/MMP-2信號通路等多種機制顯著誘導血管生成，Monti等發(fā)現(xiàn)激活PKCε可顯著促進內(nèi)皮細胞分泌bFGF，而bFGF可上調(diào)VEGF受體的表達，進而促進血管新生。研究表明，在含有脂肪間充質(zhì)干細胞的移植物中加入bFGF，相對于對照組，實驗組中VEGF呈現(xiàn)高表達，而血小板源性生長因子BB（platelet derived

growthfactor-BB，PDGF BB）以及基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrixmetalloproteinase-2，MMP-2）的表達無明顯變化，說明bFGF是通過依賴VEGF途徑來誘導血管的生成，二者協(xié)同作用從而誘導血管的生成。

2.4胰島素樣生長因子（IGF）：IGF是一種天然生長激素，IGF家族由IGF-1和IGF-2兩種組成，二者特異性結合細胞表面受體，并激活各種細胞內(nèi)信號傳導，從而調(diào)節(jié)細胞功能。對IGF的細胞應答主要由IGF-1受體介導，IGF-1受體屬于酪氨酸激酶生長因子受體。s.galajfi等最近研究通過建立小鼠體內(nèi)及體外傷口模型，證實了IGF-1可促進傷口愈合，促使血管生成，但IGF-1不會導致VEGF的上調(diào)，其誘導血管生成并不依賴于VEGF途徑。目前IGF-1促進血管生成的具體機制尚未清楚，需進一步研究證實。endprint

2.5瘦素（Leptin）：瘦素是由脂肪細胞合成分泌的內(nèi)分泌激素，在中樞和外周組織中的能量穩(wěn)態(tài)平衡中起關鍵作用，參與生殖、免疫、骨增殖和血管生成的調(diào)節(jié)，并通過作用于弓狀核來調(diào)節(jié)脂肪儲存。多項研究表明瘦素可以是有效的血管生成因子或血管生成誘導劑，在角膜囊及雞絨毛尿囊膜（CAM）兩種體內(nèi)血管生成測定模型中發(fā)現(xiàn)瘦素可直接作用于血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的瘦素受體，誘導血管的生成，同時也可通過調(diào)節(jié)VEgF，TSP-1和Ang-2，作為間接血管生成因子起作用。瘦素通過Jak/stat3信號通路調(diào)節(jié)VEGF的表達，并通過JAtC2和MAPK依賴性通路來上調(diào)血管平滑肌細胞中的TSP-1表達，在血管生成的穩(wěn)定性中發(fā)揮作用。

2.6神經(jīng)肽Y（NPY）：NPY是另一種內(nèi)分泌和旁分泌因子，是具有多效作用的交感神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)肽Y和NPY受體在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達。主要在中樞和外周組織起作用，影響脂肪組織的形成。在脂肪組織生成過程中，NPY通過激活血管內(nèi)皮細胞中的Y2受體，從而在體外和體內(nèi)刺激血管生成，并且實驗表明小鼠體內(nèi)Y2受體的缺失會導致傷口愈合延遲。進一步證實了NPY在組織缺損修復中具有促進血管生成的作用。

2.7低氧誘導因子1-α（HIF-1α）：HIF-1α是缺氧信號的主要介質(zhì)，是生理或病理狀況下血管生成的主要觸發(fā)因素。實驗表明，在低氧環(huán)境中，VEGF和b-FGF的mRNA和蛋白質(zhì)含量明顯上升，明顯促進血管內(nèi)皮細胞的生長，減少內(nèi)皮細胞凋亡。以低氧環(huán)境處理ADSCs，以延長其生存能力和激發(fā)干細胞特性，促使血管生成可能是今后研究的方向之一。同時，ADSCs在缺氧的環(huán)境中可以釋放氧化物質(zhì)、自由基及分子伴侶、熱休克蛋白等，清除受損局部區(qū)域的細胞毒性物質(zhì)，促進存活細胞的生物學活性。

3參與調(diào)節(jié)血管生成的因素

3.1血管生成素（Ang）：kng是VEGF的重要的配體。該系統(tǒng)包括血管生成素-1和-2（Ange-1和Ang-2），并且結合與Ig和表皮生長因子具有同源結構域的酪氨酸激酶（Tie：Tiel和Tie2）受體。Tiel受體對于血管發(fā)生無明顯活性，Ang-1和Ang-2通過活化Tie2受體促進血管的發(fā)生：Ange-1主要參與血管壁重塑，成熟和穩(wěn)定，介導內(nèi)皮細胞的遷移，粘附和存活；Ang-2則破壞內(nèi)皮和血管周圍細胞之間的連接并促進細胞死亡和血管退化。但Ang-2聯(lián)合VEGF又能促進新血管形成。

3.2轉(zhuǎn)化生長因子B（TGF-β）：TGF-β家族包括TGF-β₁，TGF-β₂和TGF-β₃，主要作用于細胞的增殖、分化及遷移，參與炎癥，也參與血管生成。許多小鼠和人類的遺傳研究發(fā)現(xiàn)了在血管生成過程中轉(zhuǎn)化生長因子-β信號轉(zhuǎn)導的關鍵作用。TGF-β主要通過兩種相對的Ⅰ型受體/Smad通路活化內(nèi)皮細胞，即ALK1和ALK5，直接作用于內(nèi)皮細胞的生長和遷移，并間接參與調(diào)節(jié)血管生成。TGF-β在脂肪細胞和基質(zhì)細胞中表達，可以根據(jù)內(nèi)皮細胞中的濃度和受體類型正向和負向調(diào)節(jié)血管生成。TGF-β在體內(nèi)誘導血管生成的機制尚不清楚。

3.3血小板反應蛋白（TSP）：TSP是由血小板分泌的糖蛋白，TSP-1和TSP-2是血管發(fā)生的有效內(nèi)源性抑制劑。它們直接作用于內(nèi)皮細胞，并通過拮抗VEGF的活性來抑制血管生成。TSP-1作用于血管內(nèi)皮細胞上的CD36和CD47受體，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的遷移、增殖及凋亡，從而抑制新血管的生長，并可活化處于休眠期的TGF-β，而TSP-2可競爭性抑制TSP-1介導的TGF-B活化，共同參與脂肪組織中血管形成的調(diào)節(jié)。

3.4脂聯(lián)素（adiponectin）：脂聯(lián)素是由脂肪細胞分泌的脂肪因子，脂聯(lián)素在循環(huán)中主要有三個亞型：低分子量的三聚體，中等分子量的六聚體和高分子量的多聚體。高分子量多聚體是主要的活性蛋白。在內(nèi)皮細胞上主要有兩種脂聯(lián)素受體，即R1和R2受體。脂聯(lián)素的主要作用靶點在內(nèi)皮細胞，激活半胱氨酸蛋白酶，誘發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡，抑制單核細胞黏附到內(nèi)皮細胞，最終抑制內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞的增殖、遷移和存活。脂聯(lián)素同時具有胰島素增敏、抗動脈粥樣和抗炎特性。

3.5炎性細胞：脂肪組織中炎性浸潤細胞和脂肪細胞可產(chǎn)生高水平的促血管生成因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細胞介素（IL）-1β，IL-6和IL-8。其中，TNF-α在炎癥反應中作用顯著，TNF-α在體外可促進內(nèi)皮細胞形成并抑制內(nèi)皮細胞增殖。除了其直接的血管生成活性，TNF-α是一種有效的炎性細胞因子，將炎癥、血管生成和脂肪的形成聯(lián)系起來。TNF-α還可以抑制脂肪細胞中脂聯(lián)素的mRNA表達。此外，IL-6可促進脂肪組織產(chǎn)生VEgF，從而促進血管的形成。

3.6基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）：許多證據(jù)表明了基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）系統(tǒng)在脂肪組織血管生成的潛在作用，其位于細胞外基質(zhì)（ECM），包括切割所有ECM和非ECM組分的蛋白酶以及MMP的組織抑制劑（TIMP）。組織蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶家族，對ECM中的彈性蛋白和膠原蛋白具有水解作用，在人類病原生物學中發(fā)揮重要作用，其中，組織蛋白酶B由脂肪組織分泌，可以同時調(diào)節(jié)促血管生成因子和抗血管生成因子。另外，ADAM（去整合素和金屬蛋白酶）和ADAMTS（具有TSP基序的ADAM）蛋白也具有調(diào)節(jié)血管生成和脂肪生成的功能。

4展望

脂肪組織微環(huán)境中存在各種細胞因子，它們分別發(fā)揮著不同的效應，共同調(diào)節(jié)血管的形成、生長及維持血管的穩(wěn)定性。在構建組織工程脂肪過程中，脂肪干細胞分化成脂肪細胞、內(nèi)皮細胞，脂肪細胞再與內(nèi)皮細胞相互作用，共同調(diào)節(jié)脂肪組織的生長。微環(huán)境中的各種細胞因子是必不可少的，要實現(xiàn)組織工程脂肪的血管化，需要了解微環(huán)境中各種影響脂肪組織血管生成的因素，從而建立一個良好的微環(huán)境。因此進一步完善各種影響因子的調(diào)控機制及相互作用，研究如何使組織工程微環(huán)境中各種促進血管生成因子在血管形成及生長過程中維持適當?shù)臐舛?，對構建血管化組織工程脂肪具有重要的意義。

[收稿日期]2017-01-18

[修回日期]2017-05-21

編輯/張惠娟endprint