劉璐菘，王春田，王麗敏，劉 君，劉 鴻，白 劍，張麗艷*

0 引言

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是一類具有增殖和分化能力的干細(xì)胞，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體，其可以通過增殖和分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)受損的內(nèi)皮組織進(jìn)行修復(fù)[1]。常見的臨床心血管疾病如動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病，都是以血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷為主要特征。研究顯示，當(dāng)血管內(nèi)皮受損后，膠原組織暴露，存在于末梢血液循環(huán)中的EPCs可以通過動(dòng)員、增殖和歸巢的方式黏附于膠原表面，并在其表面增殖、分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞[2-3]。但是，EPCs體內(nèi)增殖緩慢，很難滿足臨床治療需要，國(guó)內(nèi)外對(duì)EPCs的研究尚處于起步階段，因此，如何尋找到有效的方案幫助EPCs歸巢并增強(qiáng)EPCs活性具有臨床治療意義。

丹參又名長(zhǎng)鼠尾草，中醫(yī)認(rèn)為丹參味苦，微寒，入心、肝經(jīng)，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰、養(yǎng)血安神、消心除煩等功效[4-5]。而丹酚酸B作為丹參水溶性成分的主要提取物，具有多種藥理學(xué)活性，包括抗凝、抑制血小板聚集、抗氧化、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)血腦屏障和改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用。本研究在此基礎(chǔ)上，通過觀察丹酚酸B對(duì)離體的EPCs的黏附和旁分泌功能的影響，分析丹酚酸B修復(fù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 EPCs來源 經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得健康自愿者本人同意，取健康自愿者血液20 mL。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 丹酚酸B購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；M199培養(yǎng)基和PBS購(gòu)于美國(guó)GE公司；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)和胰酶購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CCK8試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；VEGF、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1)、白細(xì)胞介素8(Interleukin-8,IL-8)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloprotein9,MMP9)酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Ebioscience公司；Percoll分離液購(gòu)于美國(guó)GE公司；CD34-PE、VEGRF-2-APC和CD45-FITC購(gòu)于美國(guó)BD公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司；離心機(jī)購(gòu)于湘儀公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司；550酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；細(xì)胞流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)裝置系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)flexcell公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 EPCs原代培養(yǎng)及鑒定 在無菌條件下，將20 mL健康人的末梢血中加入等體積的Percoll分離液，放入50 mL離心管中，1 500 r/min離心20 min，吸取液面交界處的有核細(xì)胞，使用PBS稀釋后1 500 r/min離心5 min。棄上清液，將離心后的細(xì)胞在含10%胎牛血清、10 ng/mL VEGF和3 ng/mL bFGF的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，去除未貼壁的細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7 d。將細(xì)胞消化后，1 500 r/min離心5 min后棄去上清液，用PBS清洗2次，重懸細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度為1×106個(gè)/ mL，取200 μL細(xì)胞懸液，分別加入CD34-PE、VEGRF-2-APC和CD45-FITC流式抗體各5 μL，避光室溫孵育20 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、VEGRF-2和CD45的表達(dá)情況。

1.2.2 丹酚酸B促進(jìn)EPCs的增殖 將培養(yǎng)7 d的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞用胰酶消化后，按照4×103個(gè)/孔的細(xì)胞量轉(zhuǎn)到96孔板中。加入含10%胎牛血清、10 ng/mL VEGF和3 ng/mL bFGF的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h，待細(xì)胞完全貼壁后，將細(xì)胞分為2組，對(duì)照組用10%胎牛血清、10 ng/mL VEGF和3 ng/mL bFGF的M199培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同濃度的丹酚酸B：20 μg/mL丹酚酸B組、40 μg/mL丹酚酸B組和60 μg/mL丹酚酸B組。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，每組均設(shè)置5個(gè)平行孔，隔天換液，每隔24 h進(jìn)行1次CCK8試劑盒檢測(cè)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn) 將光交聯(lián)膠原10 mg與丹酚酸B 40 μg、60 μg和80 μg充分混合后，加入2 mL蒸餾水充分溶解，覆蓋在玻片上，同時(shí)取光交聯(lián)膠原100 mg溶解2 mL蒸餾水作為對(duì)照組，將丹酚酸B和對(duì)照組混合后的蓋玻片置于紫外燈下交聯(lián)4 h。將分離培養(yǎng)7 d后的EPCs經(jīng)胰酶消化后，用PBS洗去漂浮的死細(xì)胞，制成細(xì)胞密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液。將含有EPCs的混懸液以0.01 mL/min流過涂層有膠原的玻片。通過倒置顯微鏡檢測(cè)EPCs流過相同距離的時(shí)間以及最終黏附在載玻片上的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4 丹酚酸B促進(jìn)EPCs旁分泌VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9 取EPCs貼壁后和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行48 h后的培養(yǎng)基各200 μL，通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)培養(yǎng)基中VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9的濃度，方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 EPCs鑒定結(jié)果 使用倒置相差顯微鏡觀察EPCs呈梭形和多邊形，在細(xì)胞表面附著少量的懸浮細(xì)胞，細(xì)胞呈集落融合生長(zhǎng)(圖1)。經(jīng)過流式抗體CD34-PE、VEGRF-2-APC和CD45染色后，CD34、VEGRF-2和CD45 3種抗原標(biāo)記物均為陽(yáng)性的比例為89.11%±6.09%(圖2)。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察EPCs形態(tài)(40×)

圖2 培養(yǎng)7 d后EPCs表面抗原CD34、VEGRF-2和CD45鑒定結(jié)果

2.2 丹酚酸B促進(jìn)EPCs的增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 每隔24 h采集細(xì)胞并進(jìn)行光密度值檢測(cè)，第2、3、4天時(shí)，各濃度丹酚酸B組的光密度值與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且細(xì)胞增殖與丹酚酸B的濃度相關(guān)。見表1。

2.3 流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn) 取下載玻片，將其置于相差顯微鏡下，在×40目鏡下觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，不同濃度丹酚酸B組每個(gè)低倍鏡視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表2。

2.4 丹酚酸B促進(jìn)血管EPCs旁分泌VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9結(jié)果 不同濃度丹酚酸B培養(yǎng)4 d后，通過ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)基中VEGF、SDF-1、IL-8、MMP9的濃度。各濃度丹酚酸B組的VEGF、SDF-1、IL-8、MMP9濃度與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 不同濃度丹酚酸B培養(yǎng)后 EPCs增殖情況

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖3 流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)細(xì)胞黏附結(jié)果(×40)

組別細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)照組98±1320μg/mL丹酚酸B組235±24*40μg/mL丹酚酸B組393±28*60μg/mL丹酚酸B組551±35*

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討論

EPCs是一種具備分化潛能的前體細(xì)胞，在一定條件下可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。最早發(fā)現(xiàn)EPCs的是日本學(xué)者Asahara，此后的研究證明，EPCs在心肌缺血的情況下可以被迅速動(dòng)員，從骨髓進(jìn)入到外周末梢血中，歸巢至缺血損傷的心肌組織，并可以分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與缺血組織的修復(fù)[6]。現(xiàn)已證實(shí)，EPCs在多種心血管疾病中均有變化，包括冠心病、急性心肌梗死和缺血性腦卒中等[7-9]。以上疾病的共同點(diǎn)是機(jī)體出現(xiàn)短暫的缺氧狀態(tài)，由于低氧可以造成血管內(nèi)皮受損并導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞下的膠原暴露，如未得到及時(shí)有效的修復(fù)，血液循環(huán)中的炎癥細(xì)胞和血小板可以吸附于膠原組織表面，造成受損部位狹窄，甚至是栓塞等不良后果[10]。EPCs的修復(fù)則可以有效避免狹窄的形成，同時(shí)，EPCs還可以通過旁分泌作用釋放各種細(xì)胞因子，包括VEGF、bFGF、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating Factor，GM-CSF)、SDF-1、IL-8和MMP9等，這些細(xì)胞因子對(duì)促進(jìn)EPCs的骨髓動(dòng)員有著重要作用[11-13]。由于EPCs具有重要的生物學(xué)功能，臨床上已經(jīng)開展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，通過體外擴(kuò)增EPCs方式回輸入人體，但這種方法也面臨一些風(fēng)險(xiǎn)，首先是回輸?shù)腅PCs不具有成血管的功能，其次是EPCs容易被體內(nèi)巨噬細(xì)胞識(shí)別，最終轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，反而使血管損傷加重[14-15]。因此，如何有效提高EPCs黏附，誘導(dǎo)產(chǎn)生有生物學(xué)功能的EPCs成為臨床治療的重要方向。

丹酚酸B是傳統(tǒng)中藥丹參活性最強(qiáng)的水溶性成分之一，是由三分子3,4-二羥基苯基乳酸和一分子咖啡酸縮合而成的低聚體型化合物[16]。研究顯示，丹酚酸B可以有效減少心肌梗死灶的范圍、改善心肌缺血和缺血-再灌注后的氧化應(yīng)激損傷，修復(fù)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞，防止血栓形成和改善受損組織的微循環(huán)等[17-18]。研究顯示，丹酚酸B可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)VEGF，并誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞[19]。同時(shí)，丹酚酸B還可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷徙，促進(jìn)單核細(xì)胞分泌VEGF和bFGF細(xì)胞活性因子，并幫助血管形成[20]。

目前認(rèn)為血管內(nèi)皮的修復(fù)有2種方式：受損組織周圍的血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂并遷徙至受損部位或者是由末梢血液中具有分化功能的EPCs分化而來[21]。丹酚酸B對(duì)受損血管的修復(fù)作用不明，因此，本研究從成人末梢血中分離培養(yǎng)了EPCs，經(jīng)過20、40、60 μg/mL的丹酚酸B培養(yǎng)4 d后，檢測(cè)EPCs增殖的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各濃度組丹酚酸B的EPCs增殖數(shù)量與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度丹酚酸B交聯(lián)后的膠原表面吸附細(xì)胞數(shù)量明顯不同，且明顯高于對(duì)照組，并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，表明丹酚酸B可以促進(jìn)EPCs的增殖和黏附。EPCs具有旁分泌功能，這些細(xì)胞因子不僅可以動(dòng)員EPCs從骨髓中進(jìn)入外周血，還可以促進(jìn)EPCs增殖、分化、趨化和歸巢[22]。VEGF是目前已知的誘導(dǎo)EPCs向成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的最重要的細(xì)胞因子，可以促進(jìn)EPCs的骨髓動(dòng)員，促進(jìn)EPCs成熟，在EPCs增殖、分化、趨化和歸巢中起重要作用。SDF-1對(duì)EPCs的趨化作用是其他細(xì)胞因子的10倍以上，血液中SDF-1濃度升高有利于EPCs歸巢，誘發(fā)EPCs與受損內(nèi)皮黏附和血小板聚集，并抑制EPCs凋亡，在診斷和治療心肌缺血性疾病中具有重要的臨床意義；IL-8可以通過激活CXCR2受體，磷酸化Ras和MAPK信號(hào)通路中的下游蛋白而介導(dǎo)EPCs的遷徙和增殖；MMP9最初報(bào)道來源于腫瘤的侵襲性研究，研究發(fā)現(xiàn)，MMP9可以增強(qiáng)腫瘤的侵襲性，可能與其降解膠原能力有關(guān)，MMP9還可以使EPCs在骨髓內(nèi)募集并向外周血遷徙[23-25]。因此，本研究選取上述4種細(xì)胞因子，分析丹酚酸B在離體條件下對(duì)EPCs旁分泌功能是否有影響。結(jié)果顯示，不同濃度丹酚酸B在與EPCs共培養(yǎng)4 d后，可以明顯增加VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9在培養(yǎng)基中的濃度，由于在離體培養(yǎng)過程中排除了其他細(xì)胞的干擾，因此上述細(xì)胞因子的分泌只能是來源于EPCs的旁分泌功能。

表3 不同濃度丹酚酸B對(duì)EPCs培養(yǎng)基中VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9濃度的影響(pg/mL)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

綜上所述，丹酚酸B作為丹參中主要的活性成分，在體外可以促進(jìn)EPCs增殖和增強(qiáng)EPCs的黏附功能，同時(shí)可以刺激EPCs通過旁分泌作用釋放VEGF、SDF-1、IL-8和MMP9等細(xì)胞活性因子，對(duì)于治療以血管內(nèi)皮損傷為特征的疾病有著潛在的治療價(jià)值。

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