韓飛，孫凱，趙暉

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南省第二人民醫(yī)院，云南 昆明 650021；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032）

在精液的液化過程中，精液中具有抑制精子活動(dòng)作用的凝固蛋白-精液凝固蛋白（Semenogelin，Sg）被來源于前列腺的蛋白激酶分解，其主要由精囊分泌合成，存在于人類精漿中，并且具有抗菌活性[1]。SgⅠ有助于精子凝固，與Zn2+作用后可以通過前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）被蛋白酶水解，從而導(dǎo)致在射精后精子的釋放。SgⅠ在射精后與附睪蛋白酶抑制劑-附睪蛋白激酶結(jié)合，作為前列腺特異性抗原的生理底物，與SgⅡ及纖維連結(jié)蛋白Fibronectin結(jié)合形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)共同限制精子的運(yùn)動(dòng)。而后與由前列腺分泌的Zn2+結(jié)合，釋放蛋白C抑制因子，從而失去對(duì)SgⅠ的保護(hù)作用。SgⅠ、SgⅡ及Fibronectin隨即被水解，從而解除了SgⅠ對(duì)精子活動(dòng)的抑制作用，精子運(yùn)動(dòng)逐漸活躍。精子從凝固物中逸出對(duì)精子運(yùn)動(dòng)及在女性生殖道進(jìn)一步獲能具有重要的意義[2]。精液SgⅠ在生理?xiàng)l件下對(duì)精子活動(dòng)抑制作用的相關(guān)片段是本次研究的重點(diǎn)。人們認(rèn)為這種抑制活性與精子活力低下的弱精子癥患者的不育有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 試劑PET-32a載體（美國Clontech公司），Taq聚合酶（DR001A）、EcoR Ⅰ（D1040A）和KpnⅠ（D1068A）限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶（D2011A）、Wide-Range（D520A）、DL1000（D526A）、DL2000（D501A）DNA Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞（D9057）、6×R Loadingbuffer（D604）、cDNA-鏈合成試劑盒（D6110A）購自日本TaKaRa公司，TritonTMX-100（X100）、TWEEN?20（P9416）、Prestained Protein Molecular Weight Marker（SM0671）購自美國Sigma公司，質(zhì)粒小抽試劑盒（DP103）、總RNA提取試劑盒（DP419）、2×Tag PCR MasterMi（KT201）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209）購自北京天根生物公司，甲醇、乙醇、丙三醇、三氯甲烷等其他試劑均為國產(chǎn)分析純引物合成及DNA測(cè)序由深圳華大基因公司完成。

1.1.2 儀器 超凈工作臺(tái)、Forma Class Ⅱ A2 Biological Safety Cabinet、精密pH計(jì)、ORION 3 STAR PH PORTABLE購自美國Thermo Electron Corporation公司，激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），電泳儀、Bio-Rad powerpacTMuniversal、凝膠成像分析系統(tǒng)、Bio-Rad Gel Doc XR+購自美國Bio Rad公司，低溫冷凍離心機(jī)、Microfuge 22R centrifuge購自美國Beckman Conlter公司，超速冷凍離心機(jī)CR21G（日本HITACHI公司），手掌離心機(jī)C1301-230V（韓國Labnet公司），PCR儀（日本KaTaRa公司），分光光度儀GeneQuant 1300 Classic（美國GE公司）。

1.2 方法

1.2.1 重組Sg的制備 用分子克隆技術(shù)從精囊中提取精囊組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)特異性的引物，通過PCR擴(kuò)增Sg的N端和C端片段的DNA，將DNA插入質(zhì)粒載體PET32a，篩選出序列正確的陽性克隆，轉(zhuǎn)染BL21大腸埃希菌，通過誘導(dǎo)表達(dá)重組人類Sg的N端和C端片段，用鎳柱親和純化重組蛋白，通過鹽透析恢復(fù)活性，通過梯度密度離心法得到重組Sg。

1.2.2 重組Sg對(duì)精子運(yùn)動(dòng)的抑制實(shí)驗(yàn) ①精子制備：實(shí)驗(yàn)所用10例標(biāo)本均由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院男性科實(shí)驗(yàn)室提供。通過手淫法收集禁欲3～7 d后的新鮮精液標(biāo)本，水浴箱內(nèi)37℃液化30min，精液分析符合WHO標(biāo)準(zhǔn)。以Percoll不連續(xù)密度梯度離心法篩選活力優(yōu)良的精子。②計(jì)算機(jī)輔助精液分析：通過計(jì)算機(jī)輔助精液分析，記錄實(shí)驗(yàn)精子的總體活率、快速前向運(yùn)動(dòng)精子率（A級(jí)），慢速或呆滯前向運(yùn)動(dòng)精子率（B級(jí)）、精子尾部鞭打頻率（beat cross frequency，BCF）、精子平均曲線運(yùn)動(dòng)速度（curvilinear velocity，VCL）、運(yùn)動(dòng)前向性（Straightness，STR）及平均側(cè)擺幅 值（amplitude of lateral head displacement，ALH）。③精子活動(dòng)實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)選取200 pg/s為最佳作用濃度，共收集10份精液，按照200 pg/s濃度，用重組的C端精液凝固蛋白（Sg164～283）和N端精液凝固蛋白（Sg 24～163）與精子進(jìn)行作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后精子活性抑制結(jié)果比較

對(duì)照實(shí)驗(yàn)中僅加入人輸軟管培養(yǎng)液。對(duì)照組90 min后精子活率、A級(jí)、B級(jí)、VCL、VSL、BCF、ALH、STR與初始值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后Sg 24～163抑制精子活性結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)組精子各運(yùn)動(dòng)參數(shù)與初始值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Sg 24～163對(duì)精子的活動(dòng)具有抑制作用。見表2。

2.3 實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后Sg 164～283抑制精子活性結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)與初始值相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Sg164～283對(duì)精子運(yùn)動(dòng)存在一定的抑制作用。通過對(duì)Sg分解片段的進(jìn)一步分析，精液液化過程中，射精后的Sg164～283與精子表面的表面蛋白Eppin相結(jié)合的片段受到保護(hù)，Cys～239是Sg164～283與Eppin結(jié)合的唯一位點(diǎn)，當(dāng)位點(diǎn)突變時(shí)，SgⅠ失去了對(duì)精子活性的抑制作用，因此認(rèn)為Cys～239可能對(duì)SgⅠ的精子活性的抑制有著重要的作用。見表3。

表1 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后精子活性抑制結(jié)果比較 （±s）

表1 對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后精子活性抑制結(jié)果比較 （±s）

時(shí)間 活率/% A級(jí)/% B級(jí)/% VCL/（μm/s） VSL/（μm/s） BCF/（b/s） ALH/μm STR/%初始 81.20±4.21 51.20±10.38 15.20±8.25 35.52±6.25 23.58±6.23 14.56±5.23 5.32±0.85 77.56±1.96 90 min 后 76.23±5.69 48.56±12.36 16.35±7.23 36.23±5.56 26.39±5.98 18.03±3.23 4.89±0.65 74.36±2.23 t值 9.099 1.075 3.541 0.450 4.818 1.983 1.331 1.222 P值 0.096 0.936 0.412 0.425 0.365 0.338 0.985 0.501

表2 實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后Sg 24～163抑制精子活性結(jié)果比較 （±s）

表2 實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后Sg 24～163抑制精子活性結(jié)果比較 （±s）

時(shí)間 活率/% A級(jí)/% B級(jí)/% VCL/（μm/s） VSL/（μm/s） BCF/（b/s） ALH/μm STR/%初始 78.20±6.21 50.20±11.38 14.20±6.25 35.52±6.25 25.58±5.23 17.56±3.23 4.32±0.06 74.56±1.92 90 min 后 46.23±6.69 25.56±10.36 6.35±3.23 26.23±7.58 18.39±6.98 12.03± 3.23 2.89±0.05 62.36±2.22 t值 2.448 3.524 8.823 11.769 7.851 10.464 21.504 20.832 P值 0.000 0.000 0.011 0.032 0.020 0.031 0.000 0.001

表3 實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后Sg 164～283抑制精子活性結(jié)果比較 （±s）

表3 實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)前后Sg 164～283抑制精子活性結(jié)果比較 （±s）

時(shí)間 活率/% A級(jí)/% B級(jí)/% VCL/（μm/s） VSL/（μm/s） BCF/（b/s） ALH/μm STR/%初始 74.20±6.21 50.20±11.38 14.20±6.25 35.52±6.25 25.58±5.23 17.56±3.23 4.32±0.06 74.56±1.92 90 min 后 51.23±5.69 28.56±6.06 13.35±5.23 16.23±5.68 16.39±3.08 8.03±3.66 2.89±0.12 45.26±1.22 t值 31.150 37.357 1.548 32.792 2.388 24.728 6.143 35.301 P值 0.032 0.036 0.211 0.032 0.020 0.031 0.006 0.029

3 討論

附睪蛋白激酶（Eppin）由睪丸和附睪特異性分泌，存在于精子表面且含量豐富，在研究過程中被發(fā)現(xiàn)在精子活性抑制過程中有重要作用。Eppin蛋白是存在于靈長類（人類）精子一種表達(dá)良好的基本功能蛋白[3]。射精后，Eppin作為精液Sg的特異性結(jié)合受體，也是精子表面蛋白復(fù)合體（其他成分為乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、叢生蛋白、精液凝固蛋白）的一部分。該蛋白復(fù)合體能夠調(diào)節(jié)前列腺特異性抗原蛋白酶的活性，從而促進(jìn)精子液化。

Eppin中包含與精液SgⅠ結(jié)合的重要位點(diǎn)（氨基酸序列102～133片段），而與蛋白復(fù)合體中的乳鐵蛋白結(jié)合部位也在同一區(qū)域內(nèi)，故而說明Eppin在此蛋白質(zhì)復(fù)合體中與其他蛋白質(zhì)相互作用起重要作用[4]。不過，目前還有研究利用合成的SgⅠ和Eppin的氨基端及梭基端分子片段研究發(fā)現(xiàn)，射精后SgⅠ液化片段Sg 164～283結(jié)合在精子表面的Eppin第75～133氨基酸片段上，且SgⅠ分子結(jié)構(gòu)中的半膚氨酸殘基Cys～239是唯一的結(jié)合位點(diǎn)，將Cys～239用甘氨酸取代后，進(jìn)行SgⅠ重組片段的精子活性抑制實(shí)驗(yàn)。另外有研究得出不一 樣的結(jié)論，Cys～239才是對(duì)于精子活性抑制的決定性氨基酸，這與本研究的結(jié)論有差異，因目前關(guān)于精子活性研究均為體外研究并使用人工重組的衍生肽，這需要學(xué)者去進(jìn)一步研究SgⅠ及其衍生肽對(duì)精子活動(dòng)的影響。同時(shí)也有研究證明，Eppin的基因多態(tài)性與特發(fā)性男性不育癥的易患相關(guān)[5]。

精液Sg在精液液化和精子獲能的過程中通過直接參與精液凝固從而影響精子獲得向前運(yùn)動(dòng)能力[6]。青春期后，Sg大多數(shù)由精囊上皮細(xì)胞特異性分泌。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，大量的Sg抗原分布在精囊上皮細(xì)胞中，在精漿凝固中起重要作用的成分就是來源于精囊的Sg[7]。Sg包括SgⅠ和SgⅡ，在射精后的一定時(shí)間內(nèi)精液的凝固是因?yàn)樯鲜鰞烧咧g相互連接，從而抑制精子運(yùn)動(dòng)[8]。之后精液液化，精液凝固蛋白及纖維連接蛋白被PSA，在其他來源于前列腺的絲氨酸蛋白激酶作用下分解成小分子片段[8]。前列腺特異性抗原的生理底物就是精液凝固蛋白，并受Zn2+抑制呈無活性狀態(tài)[8]。射精后，前體形式的前列腺特異性抗原因Zn2+失用被激活[8]。精液液化過程中，在PSA的作用下，精液獲得向前運(yùn)動(dòng)和受精的能力[4]。精液SgⅠ水解后會(huì)產(chǎn)生具有多種生物學(xué)活性的片段。例如抗菌活性、抑制素樣活性及促甲狀腺激素釋放激素樣活性等。另外，Zn2+在精子核DNA結(jié)構(gòu)的完整性和功能方面發(fā)揮著重要的作用[9]，精子表面上SEMG1/EPPIN的相互作用也具有調(diào)節(jié)精子運(yùn)動(dòng)能力的功能[3]。所以精液Sg的分解片段，攜帶著多種功能。了解這些不同的生物學(xué)活性，對(duì)于研究精液液化的機(jī)制具有極為重要的意義。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SgⅠ的部分片段與HIV感染也有著密切的聯(lián)系[10]。

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