吳震洋，唐曉惠，付玉華，王昇，章程,3，李京津，余梅，杜小勇,3

?

藏綿羊不同毛色皮膚組織miRNA表達(dá)譜及靶基因分析

吳震洋1,2，唐曉惠4，付玉華2，王昇2，章程2,3，李京津2，余梅2，杜小勇2,3

（1銅仁學(xué)院，貴州銅仁 554300；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3華中農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物信息湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；4西藏農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝 860000）

【目的】藏綿羊又稱藏系綿羊，是中國三大粗毛羊品種之一，主要分布在西藏及其毗鄰的高寒牧區(qū)，如青海、甘肅、四川、云南等地。藏綿羊由于其被毛纖維粗長，毛質(zhì)細(xì)膩且保暖性好，是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作為一種重要的經(jīng)濟(jì)性狀，同時(shí)制約羊毛的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，目前對于綿羊毛色的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確，以藏綿羊?yàn)檠芯繉ο螅瑢ζ洳煌伾つw組織（黑色和白色）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，旨在探討miRNA在藏綿羊不同毛色皮膚組織轉(zhuǎn)錄后水平中發(fā)揮的作用及其可能參與的調(diào)控通路?！痉椒ā窟x取2只具有黑白花毛色的健康藏綿羊，減去體側(cè)被毛使皮膚完全裸露并用75%酒精消毒處理，屠宰后快速切取皮膚組織并保存在組織樣品保存液中防止RNA降解，提取RNA后通過miRNA測序和生物信息學(xué)分析，獲得藏綿羊不同毛色（黑色和白色）皮膚組織miRNA表達(dá)譜，篩選組織差異表達(dá)miRNA并預(yù)測相關(guān)靶基因。通過靶基因分析，獲得與調(diào)控藏綿羊毛色性狀可能相關(guān)的信號通路?！窘Y(jié)果】黑色和白色皮膚組織共獲得85.76兆條原始讀長，經(jīng)過濾后得到85.08兆條clean reads；共鑒定出334個(gè)已知的miRNA和59個(gè)新的miRNA；從中獲得23個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中14個(gè)差異表達(dá)miRNA在白色皮膚組織中表達(dá)顯著上調(diào)，9個(gè)表達(dá)下調(diào)。miR-2284b和miR-744僅在藏綿羊白色皮膚中表達(dá)，而miR-23b、miR-411a-5p、miR-30c、miR-423-3p和miR-324-5p則僅在藏綿羊黑色皮膚中表達(dá)，但表達(dá)量相對較低。表達(dá)量最高的miRNA為miR-10a，而倍數(shù)差異最大的為miR-23b。其中，miR-10a可參與調(diào)節(jié)多種信號通路，其作用涉及增殖、分化、凋亡、細(xì)胞粘附等各個(gè)方面，目前并無調(diào)控綿羊毛色方面的相關(guān)報(bào)道，但其功能及作用機(jī)制的研究仍在不斷擴(kuò)展。miR-23b則與Wnt、Notch等信號通路有關(guān)，這些信號通路中的部分基因也和黑色素的生成有密切關(guān)系。結(jié)合倍數(shù)差異和miRNA表達(dá)量分析，miR-411a-5p、miR103和miR-200b可能也和毛色調(diào)控密切相關(guān)。本研究共預(yù)測出981個(gè)靶基因可能參與毛色調(diào)控，多數(shù)基因和WNT信號通路、MAPK通路、EDNRB信號通路及黑素原生成通路（melanogenesis pathway）相關(guān)，其中黑素原生成通路顯示和WNT信號通路、KIT信號通路及EDNRB信號通路相互關(guān)聯(lián)。黑素原生成通路顯示藏綿羊不同毛色可能最終通過MITF基因調(diào)控下游的TYR基因（酪氨酸酶基因）影響黑色素的合成。同時(shí)，篩選7個(gè)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行定量驗(yàn)證，結(jié)果表明，5個(gè)miRNA在黑色皮膚組織中上調(diào)表達(dá)，2個(gè)miRNA在白色組織中上調(diào)表達(dá)，定量結(jié)果與測序結(jié)果一致?！窘Y(jié)論】獲得了藏綿羊皮膚組織miRNA表達(dá)譜，并通過生物信息學(xué)分析得到可能和調(diào)控毛色性狀相關(guān)的miRNA和信號通路。這些結(jié)果表明，藏綿羊毛色性狀可能受到多種miRNA的調(diào)控并涉及多個(gè)信號通路，這有助于更進(jìn)一步了解毛色轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控過程，并對進(jìn)一步的功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

藏綿羊；皮膚組織；高通量測序；miRNA

0 引言

【研究意義】研究表明，miRNA可在轉(zhuǎn)錄后通過降解或抑制黑色素形成相關(guān)基因的翻譯過程來調(diào)控毛色性狀的表達(dá)。通過高通量測序技術(shù)獲得藏綿羊皮膚組織miRNA表達(dá)譜，并篩選和毛色性狀相關(guān)miRNA，對系統(tǒng)研究轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控藏綿羊毛色性狀的通路具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的快速發(fā)展，人們逐步認(rèn)識到調(diào)控毛色的分子機(jī)制非常復(fù)雜，在黑色素細(xì)胞的遷移和分化以及黑色素的產(chǎn)生和分布等過程中受大量基因的協(xié)同調(diào)控[1-3]，涉及到許多信號通路，如Wnt信號通路[4-5]、SCF/Kit信號通路[6-7]、Notch信號通路[8-9]等。miR-27a-3p可通過靶向作用于Wnt3a從而抑制黑色素的合成[10]。miR-21a-5p可通過抑制Sox5基因下調(diào)表達(dá)MITF基因和TYR基因使得黑色素合成減少[11]。miR-211[12]、miR-508-3p[13]等可通過靶向MITF基因降低黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素的合成。miR-137則可通過多種通路靶向特定基因?qū)е潞谏睾铣伤浇档蚚14-16]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，應(yīng)用測序技術(shù)在羊毛品質(zhì)方面的研究越來越多，篩選出了一些和毛囊發(fā)育相關(guān)的miRNA[17-18]，也有部分學(xué)者利用高通量測序技術(shù)獲得羊駝、山羊等物種不同毛色皮膚miRAN表達(dá)譜[19-20]，然而在綿羊毛色方面的篩選工作鮮有報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】擬通過miRNA-Seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)更多潛在調(diào)控綿羊毛色可能的miRNA，為后續(xù)研究毛色調(diào)控的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用藏綿羊采自西藏自治區(qū)林芝市八一鎮(zhèn)，分別采集2只具有黑白花毛色的藏綿羊皮膚組織（圖1），每只藏綿羊分別取黑色和白色皮膚組織，編號分別為：1W，1B，2W，2B（數(shù)字代表藏綿羊編號，W表示白色皮膚組織，B表示黑色皮膚組織）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 藏綿羊活體狀態(tài)下，剪去藏綿羊體側(cè)羊毛，使皮膚組織完全裸露，用75% 酒精對皮膚表面消毒后屠宰綿羊，在不同毛色部位快速割取皮膚組織，迅速置于組織樣品保存液RNAstore中保存（購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司）。組織保存液保存12h后置于-80℃永久保存。

圖1 白色和黑色皮膚組織樣品采集于2只黑白花藏綿羊

1.2.2 總RNA提取、文庫構(gòu)建與測序 將凍存在-80℃保存的皮膚組織取出，置于冰盒中解凍后，將皮膚組織剪成末狀，加入1mL Trizol試劑后勻漿。室溫放置10min，在12 000 r/min 4℃條件下離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的RNAse Free的1.5mL離心管中。用RNeasy Micro kit進(jìn)行提取和純化，總RNA質(zhì)量經(jīng)Agilent2100檢測。提取的藏綿羊皮膚組織RNA樣品交由上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行文庫構(gòu)建并在Illumina Hiseq 2000平臺進(jìn)行測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 （1）FastQC（http://www. bioinformatics.babraha m.ac.uk/projects/fastqc/）和Fastx（fastx_toolkit-0.0.13.2）用于對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和預(yù)處理。（2）Bowtie（http://bowtie-bio.sourceforge. net/），用于序列比對。（3）將比對到綿羊基因組（Ensemble 基因組數(shù)據(jù)庫：http://www.ensembl.org/）上的reads，利用miRDeep2軟件[21]與miRBase20.0[22]數(shù)據(jù)庫（http://www.mirbase.org/）中綿羊及牛的miRNA序列進(jìn)行比對分析，鑒定出已知保守的miRNA和預(yù)測novel miRNA。（4）用基于負(fù)二項(xiàng)分布的DESeq軟件（http://www.bioconductor.org/ packages/release/bioc/html/edgeR.html/）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲得差異表達(dá)miRNA。（5）用TargetScan、PicTar和DIANA-microT v3.0，用于microRNA靶基因預(yù)測：A. http://www.targetscan.org/（TargetScan）；B. http://pictar.mdc-berlin.de/（PicTar）；C. http://diana. cslab.ece.ntua.gr/microT/（DIANA-microT v3.0）。（6）DAVID軟件（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）用于KEGG通路分析和GO分析。

1.2.4 cDNA及引物的合成 對提取的總RNA用全式金（北京全式金生物技術(shù)有限公司）的miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransScript miRNA RT Enzyme Mix）進(jìn)行cDNA的合成（加尾法）。委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成引物，并用于熒光定量PCR。引物序列信息見表1。

1.2.5 Real-time PCR 分析 Real-time PCR 用于檢測藏綿羊黑色和白色皮膚組織中差異表達(dá)miRNA的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系包括：Nuclease-FreeWater（3.6μL）、上游引物（0.2μL）、下游引物（0.2μL）、qPCR Master Mix（5μL），樣品1μL，構(gòu)成總體積為10μL 反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95℃變性2 min，95℃10s，60℃ 30s，72℃ 25s，40 個(gè)PCR 循環(huán)，采用默認(rèn)設(shè)置自動生成Ct 值。RT-PCR 相對定量的內(nèi)參選擇U6。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

表1 熒光定量引物基因列表

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理及數(shù)據(jù)總體情況

應(yīng)用Fastx（fastx_toolkit-0.0.13.2）對測序原始reads進(jìn)行預(yù)處理，去除接頭序列以及低質(zhì)量序列，總共獲得85 756 541條原始reads，經(jīng)過濾后得到85 076 302條clean reads，結(jié)果見表2。

篩選白色皮膚組織和黑色皮膚組織中獲得的clean reads，選取一定長度范圍內(nèi)的small RNA進(jìn)行長度統(tǒng)計(jì)分布，本試驗(yàn)過濾掉18bp以下的reads，結(jié)果見圖2。大多數(shù)reads分布在21—24nt之間，白色皮膚組織中，22nt的reads占到總reads數(shù)的20.33%，24nt的reads數(shù)占到總reads數(shù)的22.01%，同樣，黑色皮膚組織的22nt和24nt分別占到總reads數(shù)的20.16%和19.70%。

表2 數(shù)據(jù)過濾情況信息

圖2 長度分布情況

2.2 已知miRNA的鑒定

從miRBase 20.0數(shù)據(jù)庫中下載綿羊和牛的已知miRNA成熟序列和前體，從Ensemble綿羊基因組數(shù)據(jù)庫中下載綿羊的基因組數(shù)據(jù)，利用bowtie軟件將大于18bp的clean reads比對至綿羊全基因組，應(yīng)用MiRDeep2軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋分析，獲得已知的miRNA。共334個(gè)保守的miRNA被鑒定，此外預(yù)測出59個(gè)新的novel miRNA。其中75個(gè)miRNA和牛的同源，占miRNA的19.02 %，100個(gè)miRNA和綿羊的同源，占miRNA的25.45 %，山羊的則占到41.39 %（圖3）。其中，10個(gè)表達(dá)最高的miRNA見表3。

圖3 山羊miRNA注釋情況

表3 藏綿羊皮膚中表達(dá)量前10的miRNA

2.3 不同毛色皮膚組織差異表達(dá)miRNA分析

將獲得的已知miRNA用DEGseq軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，將這些數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后鑒定差異表達(dá)miRNA（圖4）?？偣茶b定出83個(gè)差異表達(dá)miRNA。通過以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選差異表達(dá)miRNA：A. 標(biāo)準(zhǔn)化后的倍數(shù)差異（log2 Fold Change）大于0.5；B. 標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)量大于100；C. p值小于等于0.001。共獲得23個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中14個(gè)差異表達(dá)miRNA在白色皮膚組織中表達(dá)顯著上調(diào)，9個(gè)則表達(dá)下調(diào)（表4）。

由圖4可以直觀的看出，差異表達(dá)的基因不多，并且以在黑色皮膚中上調(diào)表達(dá)為主。由表4可以看出，有2個(gè)miRNA（oar-miR-2284b和oar-miR-744）在黑色皮膚中不表達(dá)，有5個(gè)miRNA（oar-miR-23b，oar-miR-411a-5p，oar-miR-30c，oar-miR-423-3p，oar-miR-324-5p）在白色皮膚中不表達(dá)。部分miRNA表達(dá)量相對較低，僅有miR-23b相對表達(dá)量大于10 000。表達(dá)量相對較高的有oar-miR-103、oar-miR- 200b、oar-miR-486、oar-miR-24-3p、oar-miR-151-5p和oar-miR-10a，但倍數(shù)差異不大，其中oar-miR-10a表達(dá)量最高。

圖4 藏綿羊皮膚中已知miRNA平均值VS倍數(shù)變化作圖

2.4 novel miRNA預(yù)測

miRDeep2會根據(jù)miRNA的結(jié)構(gòu)和相近物種miRNA預(yù)測出新的miRNA，根據(jù)miRDeep2 score分值、成熟miRNA與星號miRNA比例以及預(yù)測出的miRNA二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行篩選。下表列出了在毛囊中表達(dá)的前11個(gè)novel miRNA的相關(guān)信息（表5和表6）和預(yù)測的miRNA結(jié)構(gòu)（圖5）。在這些預(yù)測的novel miRNA中，僅Novel-1-3p表達(dá)量較高，其余novel miRNA表達(dá)量很低。圖5中預(yù)測的novel miRNA的二級結(jié)構(gòu)中，紅色的表示novel miRNA的成熟序列，黃色表示頸環(huán)序列，藍(lán)色表示星號序列，紫色表示miRNA的星號序列。高通量測序技術(shù)快速發(fā)展以來，對miRNA靶基因的預(yù)測也隨之迅速開展，產(chǎn)生了大量的預(yù)測靶基因軟件。為避免單一的軟件預(yù)測可能造成較多的假陽性，本試驗(yàn)用Target Scan（http://www.targetscan. org/）、PicTar（http://pictar.mdc-berlin.de/）和DIANA- microT v3.0（http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/） 3種方法預(yù)測靶基因，將任意兩種軟件都有交叉 的miRNA篩選出來，共預(yù)測出981個(gè)靶基因可能參與到調(diào)控當(dāng)中。為了更好地將這些基因進(jìn)行歸類并統(tǒng)計(jì)分析，對這些預(yù)測的靶基因進(jìn)行了功能分析。

2.5 miRNA靶基因預(yù)測及基因功能分析

表4 藏綿羊皮膚組織差異表達(dá)miRNA

表5 藏綿羊皮膚組織中預(yù)測的novel miRNA表達(dá)量

表6 藏綿羊皮膚組織中預(yù)測的novel miRNA前體信息

圖5 預(yù)測novel miRNA的結(jié)構(gòu)

將預(yù)測出的靶基因用DAVID軟件進(jìn)行GO分析和PATHWAY通路分析。共發(fā)掘出24個(gè)通路，下圖列出了前17個(gè)可能作用于毛色的通路（圖6）。根據(jù)信號通路中包含的靶基因數(shù)量及可能的生物學(xué)意義，在這些通路當(dāng)中，MAPK信號通路、WNT信號通路、ErbB信號通路及Melanogenesis通路與毛色調(diào)控相關(guān)，這些通路分別包含預(yù)測出的70個(gè)、60個(gè)、35個(gè)和33個(gè)靶基因。

在Melanogenesis通路中（圖7），發(fā)現(xiàn)許多基因和WNT信號通路、SCF/Kit信號通路相關(guān)，通過影響MITF基因的表達(dá)起到調(diào)控毛色的作用。大量研究表明，WNT信號通路和MAPK通路及ErbB通路聯(lián)系密切，因此推測，色素的合成同時(shí)受到多種信號通路共同的作用。

將預(yù)測得到的靶基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示這些靶基因涉及116個(gè)生物學(xué)過程，包括Regulation of transcription（21%）、Transcription（16%）、Regulation of RNA metabolic process（14%）、Regulation of transcription, DNA-dependent（13%）、Intracellular signaling cascade（10%）等。這些生物學(xué)過程多與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期及增殖相關(guān)。表7中列出了前5個(gè)所涉及到的生物學(xué)過程。同時(shí)表8和表9分別列出了前5個(gè)cellular component中的分類和molecular function中的分類（表9）。

2.6 差異表達(dá)miRNA定量PCR的驗(yàn)證

選取藏綿羊黑色皮膚和白色皮膚中7個(gè)差異表達(dá)miRNA（oar-miR-411a-5p，oar-miR-30c，oar-miR-423-3p，oar-miR-628-5p，oar-miR-151-5p，oar-miR-103，oar- miR-24-3p）進(jìn)行定量驗(yàn)證，結(jié)果表明：oar-miR- 411a-5p，oar-miR-30c，oar-miR-423-3p，oar-miR-628-5p在黑色皮膚組織中上調(diào)表達(dá)，而oar-miR-103和oar-miR-24-3p兩個(gè)miRNA在白色皮膚組織中下調(diào)。與高通量測序結(jié)果一致（圖8）。其中，oar-miR-411a-5p倍數(shù)差異最大。

圖6 藏綿羊白色皮膚VS黑色皮膚樣品差異表達(dá)miRNA靶基因KEGG Pathway通路分析

圖7 Melanogenesis Pathway信號通路

表7 藏綿羊白色皮膚VS黑色皮膚樣品差異表達(dá)miRNA靶基因GO分析

表8 藏綿羊白色皮膚VS黑色皮膚樣品差異表達(dá)miRNA靶基因GO分析（Cellular Component）

表9 藏綿羊白色皮膚VS黑色皮膚樣品差異表達(dá)miRNA靶基因GO分析

**P＜0.01

3 討論

本研究利用高通量測序技術(shù)對白色和黑色皮膚組織中的miRNA進(jìn)行測序并分析了差異表達(dá)miRNA，篩選出23個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中miR-23b、miR-411a-5p、miR103、miR-10a和miR-200b可能和毛色調(diào)控關(guān)系密切。有研究表明，miR-23a可通過調(diào)控TGF-β信號通路促進(jìn)骨細(xì)胞的分化[23]，而TGF-β信號通路可間接激活Wnt/β-catenin信號通路[24]，而miR-23b則與Notch信號通路有關(guān)[25]。SUN等[26]在橫紋肌肉瘤增殖分化的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-411-5p與TGF-β信號通路和MAPK信號通路有關(guān)。所獲得的miR103、miR-10a和miR-200b差異表達(dá)miRNA在毛色調(diào)控方面還鮮有報(bào)道。這些miRNA均是參與調(diào)節(jié)多種信號通路的多功能miRNA，其作用涉及增殖、分化、凋亡、細(xì)胞粘附等各個(gè)方面，而且關(guān)于其功能及作用機(jī)制的研究仍在不斷擴(kuò)展。

通過靶基因預(yù)測并進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)毛色調(diào)控和Wnt信號通路、MAPK信號通路、EDNRB信號通路及Melanogenesis通路均有關(guān)，暗示調(diào)控毛色性狀的分子機(jī)制多樣而復(fù)雜。大量研究表明，WNT信號通路和MAPK信號通路共同影響著色素沉積[27-28]。KIM等[29]通過芯片發(fā)掘了地方牛光鼻和暗色鼻子的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)MAPK和WNT信號通路可能通過獨(dú)特的方式影響兩種性狀的表達(dá)。其中MAPK信號通路可能通過激活cAMP而導(dǎo)致真黑素的合成。YE[30]等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的WNT信號通路的激活可使小鼠毛囊毛球部位的成熟黑色素細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并且色素沉積現(xiàn)象明顯。但也有報(bào)道表明，WNT通路可以抑制黑色素的沉積，PARK等[31]通過WIF（Wnt Inhibitory Factor）在體外培養(yǎng)的人正常黑色素細(xì)胞中抑制WNT通路，發(fā)現(xiàn)MITF和TYR基因的表達(dá)量顯著上升，因此，WIF可以促進(jìn)黑色素細(xì)胞的色素沉積。YAMADA等[32]通過激光顯微切割技術(shù)分離了毛囊的四個(gè)部位（毛球部、毛囊隆突部、毛囊隆突部上部區(qū)域和下部區(qū)域），研究了Frizzled (Fzd)-4、 Fzd7、 Lrp5和Lrp6的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在毛囊隆突部這些基因均高表達(dá)。而毛囊隆突部是黑色素干細(xì)胞定居的場所。這些基因又是WNT信號通路關(guān)鍵基因，因此推測WNT信號通路在黑色素干細(xì)胞分化為成熟黑色素細(xì)胞的過程中發(fā)揮了重要的作用。本研究中，大量基因指向多種信號通路，因此具體何種信號通路起到主要調(diào)控毛色性狀仍需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究獲得藏綿羊不同毛色皮膚組織miRNA表達(dá)譜及23個(gè)差異表達(dá)miRNA，這些miRNA功能較廣且調(diào)節(jié)多種信號通路。靶基因預(yù)測和功能分析表明，調(diào)控毛色的信號通路可能涉及Wnt信號通路、MAPK信號通路等多種途徑。這為進(jìn)一步鑒定調(diào)控藏綿羊毛色的miRNA和信號通路奠定了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Profiles of miRNAs and Target Gene Analysis with White and Black Skin Tissues of the Tibetan Sheep

WU ZhenYang1,2, TANG XiaoHui4, FU YuHua2, WANG Sheng2, ZHANG Cheng2,3, LI JingJin2, YU Mei2, DU XiaoYong2,3

(1Tongren University, Tongren 554300, Guizhou;2Huazhong Agricultural University/Key Lab of Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry Education, Wuhan 430070;3Huazhong Agricultural University/Hubei Key Laboratory of Agricultural Bioinformatics, College of Informatics, Wuhan 430070;4XiZang Agriculture and Animal Husbandry College, Linzhi 860000, Tibet)

【Objective】 Tibetan sheep is one of three coarse wool sheep breeds in China, distributing mainly in Tibet and its adjacent alpine pastoral areas, such as Qinghai, Gansu, Sichuan, Yunnan. The wool of Tibetan sheep, felt smooth and warm duo to the long and thick fibers, is good raw material for manufacture of Tibetan carpet. Coat color is an important economic traits. However, at present, the mechanism of molecular regulation of sheep coat color is not clear. In this study, the transcriptome of skin tissues of different color (black and white) was sequenced with a aim to explore the role of miRNAs at post-transcriptional levels in different coat color skin tissues and possible regulatory pathways. 【Method】Healthy sheep with black and white coat color was sacrificed to provide skin tissues for RNA extraction and miRNA analysis. Through miRNA sequencing and bioinformatics analysis, miRNA expression profiles of skin tissues of black and white wool color were obtained. Then the differentially expressed miRNAs were screened and the related target genes were predicted. Through the target gene analysis, the signal pathway which is related to Tibetan coat color skin traits were proposed. 【Result】 A total of 85.76 million original reads and 85.08 million clean reads were obtained from the analyzed tissues. Among the clean reads were 334 known miRNAs and 59 newly identified miRNAs and 23 of them were differentially expressed between white and black color tissues. In the 23 differentially expressed miRNAs, 14 and 9 were up-regulated and down-regulated in white skin tissues respectively. miR-2284b and miR-744 were the type that is expressed only in white Tibetan sheep skin, and miR-23b, miR-411a-5p, miR-30c, miR-423-3p, miR-324-5p were the miRNAs that expressed only in black skin. Among them, miR-10a can participate in the regulation of a variety of signaling pathways, involving proliferation, differentiation, apoptosis, cell adhesion. MiR-23b is associated with Wnt, Notch and other signal pathways, which may related to melanin production. MiR-411a-5p, miR103 and miR-200b may also closely relate to regulation of hair color. A total of 981 target genes were predicted to be involved in coat color control, most of which were related to WNT signaling pathway, MAPK pathway, EDNRB signaling pathway and Melanogenesis pathway. The melanogenesis pathway was found to be associated with the WNT signal pathway, the KIT signal pathway, and the EDNRB signal pathway. The synthesis of melanin may be regulated by downstream TYR gene (tyrosinase gene) through MITF gene. Quantitative analysis showed that five miRNAs were up-regulated in black skin tissue, and two miRNAs were up-regulated in white tissues. The quantitative results were consistent with the sequencing results. 【Conclusion】 The miRNA expression profile of the skin of Tibetan sheep were obtained and the miRNAs and signal pathways which may be related to control of coat color were obtained by bioinformatics analysis. These results indicated that the color traits could be regulated by many miRNAs and involved many signal pathways. This may help understand the level of post-transcriptional regulation of the process, and lay the foundation for further functional verification.

Tibetan sheep; skin tissue; high throughput sequencing; miRNA

2017-06-28；

2017-11-27

國家自然科學(xué)基金（31360534, 31402040）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2662015JC010）、國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2013AA102506）

吳震洋，E-mail：wuzhenyang0724@163.com。杜小勇，E-mail：duxiaoyong@mail.hzau.edu.cn