劉希強(qiáng)，張涵，王學(xué)敏，儀登霞，王贊

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紫花苜蓿秋眠性的SSR標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析

劉希強(qiáng)，張涵，王學(xué)敏，儀登霞，王贊

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所， 北京 100193）

【目的】發(fā)掘紫花苜蓿秋眠性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，為揭示紫花苜蓿秋眠性狀的遺傳規(guī)律和分子機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā孔匣ㄜ俎ｊP(guān)聯(lián)群體由75份321個(gè)四倍體紫花苜蓿基因型構(gòu)成，其中中國(guó)紫花苜蓿品種每份材料選取6—8個(gè)基因型；其余材料每份選取3—4個(gè)基因型。利用紫花苜?；蚪M均勻分布的85對(duì)SSR（Simple sequence repeats）標(biāo)記，對(duì)321個(gè)紫花苜蓿基因型進(jìn)行掃描。于2014—2015年連續(xù)兩年對(duì)紫花苜蓿秋眠性開展調(diào)查，并利用一般線性模型（GLM）及混合線性模型（MLM）2種方法，開展秋眠性與SSR分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析?！窘Y(jié)果】紫花苜蓿秋眠性表現(xiàn)出極顯著的基因型、年際及基因型×年際互作效應(yīng)。2014年，表型變異幅度為5.1—55.1 cm，平均值為22.4 cm，變異系數(shù)為45.5%。2015年，變異幅度在3.5—44.9 cm，平均為15.2 cm，變異系數(shù)為43.7%。秋季株高兩年均呈現(xiàn)接近正態(tài)分布特征。廣義遺傳力為0.71。MLM模型很好的控制了紫花苜蓿秋眠性的假陽性關(guān)聯(lián)。基于MLM模型，在2014年共找到12個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)，表型貢獻(xiàn)率為2.42%—6.73%。2015年共找到11個(gè)，表型貢獻(xiàn)率為2.45%—4.81%。在這些關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中，分布于Chr 2的m83_157、Chr 3的m525_230和m525_231、及Chr 4的m429_245，在兩種模型及兩年內(nèi)均被重復(fù)檢測(cè)到。【結(jié)論】通過兩種模型發(fā)掘到4個(gè)與紫花苜蓿秋眠性顯著相關(guān)的位點(diǎn)，經(jīng)過驗(yàn)證后可以用于紫花苜蓿秋眠性分子標(biāo)記輔助選擇育種。

紫花苜蓿；秋眠性；關(guān)聯(lián)分析；SSR標(biāo)記

0 引言

【研究意義】紫花苜蓿（L.）是世界上最重要的栽培牧草之一。秋眠性是其適應(yīng)晚秋日照縮短、溫度降低的一種生長(zhǎng)特性[1]。紫花苜蓿秋眠性是其引種、區(qū)劃及種植期選擇的重要理論依據(jù)。因此，揭示紫花苜蓿秋眠性遺傳規(guī)律，實(shí)現(xiàn)紫花苜蓿秋眠性的基因定位，并獲得與之緊密連鎖的分子標(biāo)記，對(duì)紫花苜蓿正確引種及區(qū)劃具有重要的指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】紫花苜蓿秋眠性的概念是Oakley和Westover在1921年提出的[2]，至今已有近百年。在這期間，科學(xué)家們用大量時(shí)間對(duì)秋眠性測(cè)定的方法、理論開展了研究，形成了目前以秋季最后一次收割后植株生長(zhǎng)高度為標(biāo)準(zhǔn)的9級(jí)/11級(jí)分級(jí)體系[3-4]。紫花苜蓿秋眠性被認(rèn)為受到光照和溫度的共同調(diào)控。因此，利用表型[5-6]、生理生態(tài)[7-8]、及分子生物學(xué)[9-10]手段，研究光照和低溫對(duì)紫花苜蓿秋眠性調(diào)控也得到廣泛開展。Fan等[11]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，比較分析了不同秋眠級(jí)紫花苜蓿在秋眠過程中的microRNA表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)28個(gè)miRNA參與了秋眠性的調(diào)控，其中含20個(gè)已知miRNA和8個(gè)新報(bào)道m(xù)iRNA。Li等[12]利用不同標(biāo)記對(duì)苜蓿分離群體開展秋眠性的QTL定位研究，對(duì)揭示紫花苜蓿秋眠性分子遺傳機(jī)制提供了重要的參考。紫花苜蓿秋眠性是典型的復(fù)雜數(shù)量性狀，目前針對(duì)其QTL定位研究主要以連鎖分析為主。以連鎖不平衡為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)分析以現(xiàn)有的自然群體為材料，無需構(gòu)建專門的作圖群體，多態(tài)性標(biāo)記的覆蓋面和多種等位基因型以及利用歷史上的重組事件，使關(guān)聯(lián)定位較傳統(tǒng)的連鎖分析具有精度高、廣度大的優(yōu)點(diǎn)[13-15]。【本研究切入點(diǎn)】近年來雖然紫花苜蓿關(guān)聯(lián)分析已有應(yīng)用[16-17]，但對(duì)其秋眠性的研究還未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以來源于世界各地的紫花苜蓿種質(zhì)為材料，采用均勻分布于紫花苜蓿全基因組的SSR引物，對(duì)紫花苜蓿秋眠性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，旨在發(fā)掘與其相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，為揭示其遺傳調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2012—2015年在河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作農(nóng)業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜蓿關(guān)聯(lián)群體由75份四倍體紫花苜蓿種質(zhì)構(gòu)建[17]，其中9個(gè)中國(guó)紫花苜蓿品種由國(guó)家草種質(zhì)資源庫(kù)提供，2份敘利亞種質(zhì)，1份利比亞種質(zhì)，1份蘇丹種質(zhì)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供，其余62份由美國(guó)國(guó)家種質(zhì)資源系統(tǒng)（NPGS）提供。中國(guó)的紫花苜蓿品種，每份材料選取7—8個(gè)基因型；其余材料每份選取3—4個(gè)基因型，共321個(gè)基因型。試驗(yàn)為隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)基因型2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包括6個(gè)無性扦插苗，株距30 cm，小區(qū)間距75 cm。

1.2 表型鑒定

紫花苜蓿秋眠性用秋季株高表示，在一年中最后一次刈割約21 d后進(jìn)行植物株高測(cè)量。2013—2015連續(xù)3年進(jìn)行測(cè)定，由于2013年數(shù)據(jù)缺失較多，所以本試驗(yàn)對(duì)2014、2015兩年數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3 SSR標(biāo)記分析

DNA提取采用CTAB法。試驗(yàn)所使用的85對(duì)SSR標(biāo)記來源于Eujayl等[18]和Robins等[19]。基因型鑒定采用DNA測(cè)序儀（ABI 3730XL）進(jìn)行[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SAS 8.02的GLM（General linear model）對(duì)兩年秋季株高數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，同時(shí)進(jìn)行廣義遺傳力分析。群體結(jié)構(gòu)采用STRUCTURE 2.2分析[20]，群體結(jié)構(gòu)分類標(biāo)準(zhǔn)為Q值>0.7，否則定為Mix群體。親緣關(guān)系矩陣（K）采用SPAGeDi分析[21]。采用Tassel v2.1的GLM（general linear model）和MLM（mixed linear model）兩種模型進(jìn)行性狀和標(biāo)記之間的關(guān)聯(lián)分析[22]。性狀與標(biāo)記之間顯著關(guān)聯(lián)的閾值設(shè)為<0.005。

2 結(jié)果

2.1 紫花苜蓿關(guān)聯(lián)群體秋季株高變異分析

321個(gè)紫花苜蓿基因型秋季株高2014—2015兩年結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表1所示。2014年，秋季株高平均為22.4 cm，變異幅度在5.1—55.1 cm，變異系數(shù)為45.5%。2015年，秋季株高平均為15.2 cm，變異幅度在3.5—44.9 cm，變異系數(shù)為43.7%（表1）。方差分析（ANOVA）結(jié)果顯示，紫花苜蓿秋季株高在321個(gè)基因型之間表現(xiàn)出極顯著差異（<0.01），說明不同基因型之間紫花苜蓿秋季株高多樣性豐富（表1）。同時(shí)，該性狀表現(xiàn)出極顯著的年際及年際×基因型互作效應(yīng)，說明該性狀具典型的數(shù)量性狀特性。如表1所示，該性狀廣義遺傳力為0.71，說明該性狀受遺傳控制程度較大。

年際間相比，除群體I年際之間差異不顯著外，2015年所有基因型、群體II及Mix群體平均秋季株高均顯著低于2014年（圖1）。正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，紫花苜蓿秋季株高兩年均呈現(xiàn)接近正態(tài)分布特征（圖2）。

2.2 紫花苜蓿秋季株高關(guān)聯(lián)分析

為了控制假陽性關(guān)聯(lián)，利用GLM和MLM兩種模型對(duì)紫花苜蓿秋季株高進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表2、圖3所示。由表2可知，利用GLM模型2014和2015年分別鑒定51和34個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)，遠(yuǎn)高于MLM模型（12和11個(gè)）。這是由于MLM模型考慮了群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系2個(gè)方面，降低了假陽性關(guān)聯(lián)，因此檢測(cè)到的位點(diǎn)大幅降低。這個(gè)結(jié)論在圖3的QQ-plot中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。由圖3可知，MLM模型的觀測(cè)值比GLM模型更接近預(yù)期值，說明MLM模型很好的控制了紫花苜蓿秋季株高的假陽性關(guān)聯(lián)。

表1 紫花苜蓿秋季株高表型變異

**顯著性水平＜0.01; **Significant at＜0.01

箱圖兩端表示其性狀的極值范圍，點(diǎn)圈表示個(gè)別極值，中間直線表示性狀中位數(shù)。T-14、T-15、I-14、I-15、 II -14、II-15、M-14、M-15分別代表2014和2015年全部基因型、亞群I、亞群II及Mix群體

圖2 2014—2015年紫花苜蓿秋季株高頻率分布圖

圖3 紫花苜蓿秋季株高關(guān)聯(lián)分析兩種模型的QQ圖

基于MLM模型（表3），在2014年共找到12個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)，除Chr 8外，其余染色體上均有分布，表型貢獻(xiàn)率為2.42%—6.73%。2015年共找到11個(gè)，分布在Chr1、2、3、4、6、8染色體上，表型貢獻(xiàn)率為2.45%—4.81%（表3）。綜合兩年結(jié)果，分布于Chr 2和Chr 3上的均占到一半，說明調(diào)控紫花苜蓿秋季株高的等位基因位點(diǎn)及候選基因主要分布于這兩條染色體上。在這些關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中，分布于Chr 2的m83_157、Chr 3的m525_230和m525_231、及Chr 4的m429_245，不僅在2014和2015年重復(fù)檢測(cè)到（表3），而且在兩種模型中均重復(fù)檢測(cè)到。顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的等位基因效應(yīng)見表3。在2014年中，除第5條染色體的m53_114為正效應(yīng)外（4.61 cm），其余11個(gè)均為負(fù)效應(yīng)，其中位于第4條染色體的m429_245負(fù)效應(yīng)最強(qiáng)（-16.11 cm）。在2015年中，11個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中有3個(gè)為正效應(yīng)，8個(gè)為負(fù)效應(yīng)。其中，位于Chr 6的m329_206正效應(yīng)最強(qiáng)（1.96 cm），位于Chr 4的m429_245負(fù)效應(yīng)最強(qiáng)（-19.19 cm）。

表2 紫花苜蓿秋季株高不同模型關(guān)聯(lián)分析

表3 紫花苜蓿秋季株高關(guān)聯(lián)位點(diǎn)及表型變異的貢獻(xiàn)率

3 討論

本試驗(yàn)檢測(cè)到紫花苜蓿秋季株高廣義遺傳力為0.71，這與LI等[12]研究結(jié)果相似（0.74），而高于BROUWER等[23]的結(jié)果（0.45、0.63）。總的來說，紫花苜蓿秋眠性主要受遺傳調(diào)控，因此適宜于通過遺傳方法進(jìn)行改良。

紫花苜蓿是同源四倍體（2n=4X=32），具有異花授粉、高度雜合、自交不親和及基因組信息少等特點(diǎn)，使紫花苜蓿遺傳圖譜構(gòu)建和QTL 定位等領(lǐng)域進(jìn)展緩慢。自YU等[24]1993年利用RAPD標(biāo)記構(gòu)建了第一張四倍體紫花苜蓿遺傳圖譜以來，迄今為止，已構(gòu)建了十余張四倍體紫花苜蓿的遺傳圖譜。許多與產(chǎn)量/形態(tài)性狀[18,25]、持久性[26]、抗寒性[12,23]、抗病蟲[27-28]、水分利用效率及抗旱性[29-30]等性狀相關(guān)的QTL已經(jīng)在四倍體紫花苜蓿連鎖圖譜上進(jìn)行了定位。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)秋眠性開展的研究并不多。BROUWER等[23]利用RFLP標(biāo)記對(duì)兩個(gè)苜蓿分離群體進(jìn)行了秋眠性QTL分析，分布于Chr 1、Chr 3、和Chr 8的3個(gè)相關(guān)標(biāo)記在多個(gè)環(huán)境中被重復(fù)檢測(cè)到。LI等[16]報(bào)道指出，分布于Chr 1和Chr 7號(hào)染色體的2個(gè)秋眠相關(guān)QTL在多個(gè)環(huán)境中被重復(fù)檢測(cè)到。紫花苜蓿秋眠性是受光溫調(diào)控的復(fù)雜數(shù)量性狀，關(guān)聯(lián)分析是研究復(fù)雜數(shù)量性狀的有效方法。本研究中，分別利用GLM和MLM兩種模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。通過GLM模型，有15個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在兩年內(nèi)均檢測(cè)到，而在MLM模型中僅有4個(gè)被重復(fù)檢測(cè)到，分別位于Chr 2、Chr 3、Chr 4號(hào)染色體上。這4個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)在GLM模型中也被重復(fù)檢測(cè)到，表明這些標(biāo)記較穩(wěn)定。而且，這4個(gè)位點(diǎn)在前人研究中未見報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)。

4 結(jié)論

利用多樣性豐富的321個(gè)紫花苜蓿基因型構(gòu)成的關(guān)聯(lián)群體，對(duì)其秋眠性狀開展關(guān)聯(lián)分析，利用GLM和MLM兩種關(guān)聯(lián)模型分別檢測(cè)到85個(gè)和23個(gè)與紫花苜蓿秋眠性相關(guān)標(biāo)記，其中4個(gè)新位點(diǎn)在兩種模型和兩年中均被檢測(cè)到，分別位于Chr 2、Chr 3、Chr 4號(hào)染色體上。研究結(jié)果為克隆新的秋眠性相關(guān)基因以及通過分子標(biāo)記輔助育種加速紫花苜蓿新品種培育提供了有用信息。

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[29] RAY I M, HAN Y H, LEI E, MEENACH C D, SANTANTONIO N, SLEDGE M K, PIERCE C A, STERLING T M, KERSEY R K, BHANDARI H S, MONTEROS M J. Identification of quantitative trait loci for alfalfa forage biomass productivity during drought stress., 2015, 55: 2012-2033.

[30] ZHANG T J, YU L X, ZHENG P, LI Y J, RIVERA M, MAIN D, GREENE S L. Identification of loci associated with drought resistance traits in heterozygous autotetraploid alfalfa (L.) using genome-wide association studies with genotyping by sequencing., 2015, 10(9): e0138931.

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Association Mapping of Fall Dormancy with SSR Markers in Alfalfa (L.)

LIU XiQiang, ZHANG Han, WANG XueMin, Yi DengXia, WANG Zan

(Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)

【Objective】The aim of this study was to identify simple sequence repeat (SSR) loci associated with fall dormancy in alfalfa (L.) for understanding its inheritance pattern and molecular mechanism.【Method】The association population was composed of a total of 321 tetraploid genotypes from 75 alfalfa accessions, and each of the Chinese accessions was represented by six to eight genotypes, while the remaining ones included three to four genotypes. All the 321 materials were genotyped using 85 SSR markers randomly distributed on alfalfa genome. The phenotyping data of fall dormancy trait of these alfalfa accessions was obtained in 2014 and 2015, and used together with the SSR genotyping results for an association mapping by using General Line Model (GLM) and Mixed Line Model (MLM) models.【Result】It was showed that the fall dormancy trait in alfalfa was significantly influenced by genotypes, years, and genotype × year interactions. The fall plant heights ranged between 5.1 cm and 55.1 cm, and between 3.5 cm and 44.9 cm, averages of 22.4 cm and 15.2 cm, and coefficients of variation at 45.5% and 43.7% in 2014 and 2015, respectively. This trait showed a normal or nearly normal distribution in both 2014 and 2015 and had a relatively high broad-sense heritability at 0.71. The MLM model which adequately controlled false positives identified a total of 12 and 11 significant associations accounting for 2.42% to 6.73% and 2.45% to 4.81% of the phenotypic variances in 2014 and 2015, respectively. Among them, four loci of m83_157 on Chr. 2, m525_230 and m525_231 on Chr. 3, and m429_245 on Chr. 4 were detected in the two years by using the two models.【Conclusion】It was concluded that the four association loci related to fall dormancy in alfalfa were identified, and would be subjected to functional verification so that they could be eventually used for alfalfa marker assisted selection breeding.

alfalfa; association mapping; SSR marker; fall dormancy

2017-08-02；

2017-11-23

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS34）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31272495）

劉希強(qiáng)，E-mail：261099930@qq.com。

王贊，E-mail：wangzan@caas.cn