賀璽鸝

摘 要：通過(guò)石蠟制片法研究缺氮對(duì)玉米根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，分別以缺氮玉米及正常玉米的根系組織作為實(shí)驗(yàn)材料，利用傳統(tǒng)石蠟切片法，對(duì)組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色等一系列處理，通過(guò)顯微技術(shù)得到組織圖片，獲得了厚度為10μm且染色清晰、組織結(jié)構(gòu)完整的缺氮和正常玉米根橫切切片，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，明顯可以觀察到三葉一心的玉米經(jīng)缺氮處理后其根部通氣組織有明顯變化，可為玉米氮吸收的機(jī)理研究提供一定參考。

關(guān)鍵詞：玉米；缺氮處理；石蠟制片

玉米是世界上最重要的糧食、淀粉和工業(yè)原料作物。玉米作為我國(guó)第一大作物，其生產(chǎn)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有極其重要的地位。玉米也是一種重要的對(duì)高等植物進(jìn)行遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究的模式生物。氮肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要與用量最大的肥料，但玉米種植中氮肥的大量使用也造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題，例如環(huán)境污染以及由于過(guò)度使用肥料，尤其是氮肥造成的土壤酸化，損害了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。而低氮條件下玉米生理結(jié)構(gòu)的改變研究對(duì)如何提高玉米氮肥利用效率與耐低氮具有重要意義。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)缺氮玉米的根系組織進(jìn)行了切片制作及顯微分析，旨在了解缺氮對(duì)玉米根系組織結(jié)構(gòu)及營(yíng)養(yǎng)狀況的影響。

一、材料與方法

1.材料的處理

選取顆粒飽滿，籽粒均一的玉米種子，30%的H2O2浸泡15min用蒸餾水將玉米殘留的H2O2沖洗干凈，25℃下浸泡8h后萌發(fā)36h。待種子根部生長(zhǎng)至2cm時(shí)，移入8個(gè)水培盆中，先用1/2Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)1d后換為Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，待玉米生長(zhǎng)至三葉一心時(shí)期，取4盆換用Hoagland缺氮培養(yǎng)液作為處理組（UN），另外4盆仍用Hoagland培養(yǎng)液作為對(duì)照組（CK），待缺氮玉米出現(xiàn)明顯變化后，分別取實(shí)驗(yàn)組（UN）和對(duì)照組（CK）玉米根系組織，液氮速凍后保存于-80℃待用。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（1）樣品的分割與固定。將處理和對(duì)照根切成長(zhǎng)約2毫米的小段，割取后立即投入預(yù)先準(zhǔn)備好的FAA固定液中，將氣泡抽出，使材料下沉進(jìn)行固定。

（2）沖洗與苯胺番紅整體染色。材料固定后，用70%酒精沖洗材料，沖洗2次，每次放置30 min，再經(jīng)50%、30%、酒精復(fù)水至蒸餾水，每級(jí)1h。再入苯胺番紅溶液整染過(guò)夜。

（3）石蠟制片。材料整染后，用蒸餾水洗掉浮色，經(jīng)20%、30%、50%、70%脫水，每級(jí)1h；85%、95%、100%、100%各級(jí)酒精脫水，每級(jí)1h，然后依次使用1/2二甲苯+1/2純酒精、二甲苯、二甲苯透明，每級(jí)1h。

（4）浸蠟。將組織留在透明劑（二甲苯）瓶中，在小半瓶冷的二甲苯上中填滿已熔化的石蠟，倒入的石蠟即凝成固體，然后將材料放在35—37℃之間的溫箱內(nèi)放置2d。將材料移入56℃的恒溫箱中停留2—5h，換三次新鮮的純石蠟，使留在組織內(nèi)的透明劑全部排除后包埋。

（5）包埋。將浸蠟完成后的石蠟和根組織一起倒入包埋用的紙盒中，根據(jù)切片的要求，將材料每隔1cm放置一個(gè) ，除去氣泡、插入標(biāo)簽后將紙盒放入冷水水槽，使盒中包埋塊迅速冷卻，1h時(shí)后將紙盒打開取出包埋的蠟塊貯藏備用。

（6）切片、貼片、展片與烤片。使用切片機(jī)切出10μm厚度的蠟帶，將切好的蠟帶用赫伯特粘貼劑將蠟片粘貼在載玻片上。然后將帶有蠟帶的載玻片放在40℃展片臺(tái)上伸展，蠟片完全伸平后，吸去多余的水，烤干后放入切片盒中。

（7）脫蠟、復(fù)染（固綠）與封片。將烤干的切片入二甲苯（2次）脫蠟，每級(jí)30min，然后入100% 酒精、95%酒精復(fù)水，每級(jí)5min，苯胺固綠溶液復(fù)染3—5 min，95%酒精分色2 min；然后用100% 酒精脫水2次，二甲苯透明2次，每級(jí)5 min；最后用封固劑封片。

（8）觀察。使用顯微鏡對(duì)玉米各切片進(jìn)行觀察。

二、結(jié)果與分析

1.玉米處理結(jié)果

對(duì)玉米缺氮處理后，其生長(zhǎng)的結(jié)果（圖1）顯示：1、與對(duì)照組相比缺氮玉米葉片出現(xiàn)明顯發(fā)黃，特別是靠近葉根基部的第一片葉子已經(jīng)明顯變黃，該葉片所在莖區(qū)顏色明顯變紅；2、與對(duì)照組相比缺氮玉米根生長(zhǎng)變快，根長(zhǎng)明顯增加，側(cè)根生長(zhǎng)加快、變長(zhǎng)變細(xì)。與謝孟琳等人的研究結(jié)果一致，缺氮條件下植物根系伸長(zhǎng)變細(xì)以增加對(duì)氮素的吸收面積從而提高對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)能力，Liu等人的在羊草中的研究也有類似的結(jié)果。

2.制片效果及對(duì)照玉米組織結(jié)構(gòu)分析

石蠟切片中植物組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)是否完整，顏色是否鮮明是判斷切片質(zhì)量的主要指標(biāo)。從圖2、3可以得到組織結(jié)構(gòu)完整、番紅-固綠二重染色對(duì)比清晰的玉米根及葉部分組織的橫切圖片。

玉米根基部橫切面（圖2），由外向內(nèi)依次為表皮細(xì)胞、由薄壁細(xì)胞組成的外皮層，中皮層，及內(nèi)皮層等機(jī)械組織、凱氏帶、中柱鞘、木質(zhì)部、韌皮部組成的維管束。在外皮層的部分明顯能觀察到通氣組織，通氣組織是植物薄壁組織內(nèi)一些氣腔或空腔的集合，在缺氧條件下，如水淹時(shí)一些植物根皮層細(xì)胞會(huì)發(fā)生死亡解體而形成通氣組織利用把氧氣運(yùn)送到根基部以保證根的代謝需要這一過(guò)程對(duì)于植物在缺氧條件下的生長(zhǎng)具有重要的意義。維管束由內(nèi)到外依次為初生韌皮部、次生韌皮部、次生木質(zhì)部、初生木質(zhì)部，髓鞘；在中柱鞘中穿插有外側(cè)的篩管和內(nèi)側(cè)的導(dǎo)管。

3.缺氮玉米組織分析

對(duì)圖2、圖3對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，玉米經(jīng)缺氮處理后，其根部皮層地的通氣組織結(jié)構(gòu)變化最為明顯，正常玉米根部的通氣組織（圖2-8）可分為多個(gè)氣室，氣室較小，氣室之間分割明顯，各薄壁細(xì)胞為球形，結(jié)構(gòu)基本完整，可清晰辨別出各氣室。而缺氮玉米根部的通氣組織（圖3-8）各氣室兩側(cè)的薄壁細(xì)胞基本溶解，氣室相互連通，排布雜亂，單個(gè)氣室不可辨別，所有氣室圍繞在凱氏帶外側(cè)連接形成環(huán)狀空缺，周圍的薄壁細(xì)胞形狀為不規(guī)則形，結(jié)構(gòu)破裂。除皮層外其他根組織結(jié)構(gòu)（如維管束）基本沒有變化，結(jié)構(gòu)完整。該結(jié)果表明玉米在氮缺乏的情況下，根系的皮層組織會(huì)產(chǎn)生一定的破壞，使得通氣組織分布擴(kuò)大，進(jìn)而提高蒸騰拉力，促進(jìn)根系對(duì)氮素的吸收。endprint

三、討論

玉米經(jīng)缺氮處理后，葉片變黃，玉米根生長(zhǎng)變快，根長(zhǎng)明顯增加，側(cè)根生長(zhǎng)加快、變長(zhǎng)變細(xì)，說(shuō)明氮素的供應(yīng)不足嚴(yán)重的導(dǎo)致了玉米的生長(zhǎng)狀況，使得玉米葉片表現(xiàn)出發(fā)黃枯死的癥狀。而且，在玉米氮供應(yīng)不足的情況下，玉米必須通過(guò)增加根與地面的相對(duì)表面積從而提高氮的吸收效率。

本實(shí)驗(yàn)獲得了厚度為10μm且染色清晰、組織結(jié)構(gòu)完整的玉米缺氮和正常根及玉米正常葉橫切切片。切片分析結(jié)果顯示三葉一心的玉米經(jīng)缺氮處理后其根部通氣組織產(chǎn)生了明顯變化，張緒成等人的研究顯示氮脅迫下玉米的蒸騰作用增加，通過(guò)蒸騰拉力更好的吸收營(yíng)養(yǎng)和水分；王寶山的研究指出由環(huán)境脅迫引起的生物自由基的積累可導(dǎo)致膜的完整性破壞和差別透性喪失，如氮脅迫下丙二醛含量的增加，會(huì)導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的破壞。因此，我們推測(cè)，氮脅迫下玉米需要提高機(jī)體中氮的吸收效率，通過(guò)增加丙二醛等生物自由基的積累破壞根系的皮層組織，從而使得根皮層中通氣組織的分布大量增加，進(jìn)而提高蒸騰拉力，促進(jìn)根系對(duì)氮素的吸收。

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