張守坤　高易凡　劉侃

摘要：微流控領(lǐng)域自二十世紀(jì)末誕生以來，憑借其高效率、低消耗的技術(shù)優(yōu)勢，在生命科學(xué)、化學(xué)合成和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域顯示出了巨大的應(yīng)用前景。為了改良微流控芯片的進(jìn)一步作用，使得優(yōu)勢更加明顯，對微流控芯片溝道內(nèi)表面進(jìn)行改造，在溝道的內(nèi)表面構(gòu)筑一些納米結(jié)構(gòu)。該文研究的主要內(nèi)容是在有抗腐蝕涂層的情況下，玻璃刻蝕液對玻璃在不同的時(shí)間下所刻蝕出的三維結(jié)構(gòu)的區(qū)別，即納米結(jié)構(gòu)的尺寸差異。不同尺寸的納米結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的富集能力不同，找出最適合的三維結(jié)構(gòu)并制作出微流控芯片。結(jié)果表明在有納米結(jié)構(gòu)修飾比沒有納米結(jié)構(gòu)修飾的微流控芯片對細(xì)胞富集效率高。

關(guān)鍵詞：三維微結(jié)構(gòu)；納米顆粒涂層；細(xì)胞富集；微流控芯片

中圖分類號：TP18 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-3044（2018）02-0204-02

Microfluidic Chip Based on Three Dimensional Microstructure

ZHANG Shou-kun 1，GAO Yi-fan 2，LIU Kan *

（Wuhan Textile University， Wuhan 430200，China）

Abstract：Since its birth in the last century， microfluidics has shown great application prospects in life sciences， chemical synthesis and environmental monitoring， because of its high efficiency and low consumption technology advantages. In order to improve the further role of microfluidic chip and make the advantage more obvious， we reconstruct the inner surface of microfluidic chip and build some nanostructures on the inner surface of the channel. The main content of this paper is the difference between the three dimensional structures etched by glass etch on glass at different time under the condition of corrosion resistant coating， that is， the size difference of nanostructures. Different sizes of nanostructures have different ability to enrich the cells， find the most suitable three-dimensional structure and make microfluidic chips. The results show that the microfluidic chip with nano structure modification is more efficient than the microchip without nano structure modification.

Key words：three dimensional microstructures； nano particle coating； cell enrichment； microfluidic chip

微流控分析芯片最初只是作為納米技術(shù)革命的一個(gè)補(bǔ)充，在經(jīng)歷了大肆宣傳及冷落的不同時(shí)期后，最終卻實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)。微流控分析芯片最初在美國被稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室”（lab-on-a-chip），在歐洲被稱為“微整合分析芯片”（micrototal analytical systems），隨著材料科學(xué)、微納米加工技術(shù)和微電子學(xué)所取得的突破性進(jìn)展，微流控芯片也得到了迅速發(fā)展?？梢园焉铩⒒瘜W(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。有著體積輕巧、使用樣品及試劑量少，且反應(yīng)速度快、可大量平行處理及可即用即棄等優(yōu)點(diǎn)的微流控芯片，在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著的巨大潛力，近年來已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料、機(jī)械等學(xué)科交叉的嶄新研究領(lǐng)域。為了滿足微流控芯片在不同場合下應(yīng)用，顯示出微流控已有的技術(shù)優(yōu)勢和能夠使用不同環(huán)境的能力，需要對微流控芯片的溝道進(jìn)行一些改造，能夠滿足設(shè)計(jì)要求。目前在微通道表面上制造納米結(jié)構(gòu)的微納加工技術(shù)主要有濕法刻蝕、干法刻蝕技術(shù)、光刻法、LIGA技術(shù)等。

1 TiO2懸浮液的制備

1） 將40ml無水乙醇加入到體積為250ml的錐形瓶中，然后用移液槍分別吸取435ul去離子水和148ul甲胺（CH3NH2）滴加到錐形瓶中，室溫下進(jìn)行磁力攪拌30min，再在磁力攪拌下緩慢加入40ml乙腈（C2H3N），得到甲溶液；

2） 將20ml無水乙醇加入到體積為100ml的燒杯中，然后用移液槍吸取2.14ml異丙醇鈦（TTIP），并緩慢加入到燒杯中，均勻攪拌，得到乙溶液；

3） 將乙溶液緩慢滴加到含有甲溶液的錐形瓶中，滴加完成后，先將錐形瓶放置在通風(fēng)櫥中磁力攪拌3h，再靜置4天至沉淀完全，去除上清液，得到下層沉淀物，將下層沉淀物均勻分散在30ml無水乙醇中，得到分散液；

4） 將分散液倒入2個(gè)體積為15ml的離心管中，2個(gè)離心管中液體的體積均為15ml，并將2個(gè)離心管對稱放入離心機(jī)中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，然后將2個(gè)離心管的上清液倒掉3ml上清液，加入3ml無水乙醇，并保持兩個(gè)離心管中液體的體積均為15ml，繼續(xù)以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，如此反復(fù)三次，離心完成后過濾，將濾餅重新分散在30ml無水乙醇中，再用超聲儀超聲分散30min，得到含有球型TiO2微納米粒子的懸浮液。endprint

2 三維微結(jié)構(gòu)的制備與表征

1） 取一片光學(xué)玻璃片（面積：25*75mm2），然后將光學(xué)玻璃片超聲清洗干凈，吹干，再將TiO2微納米粒子的懸浮液（TiO2微納米粒子的直徑為0.5～1um，TiO2懸浮液的質(zhì)量百分濃度為0.5%）噴涂在光學(xué)玻璃片的一表面上，將光學(xué)玻璃片在25℃下晾10min進(jìn)行干燥處理，從而使光學(xué)玻璃片的表面上沉積有TiO2微米粒子涂層；

2） 將光學(xué)玻璃片浸泡在刻蝕液中進(jìn)行刻蝕，刻蝕速率為1um/min，刻蝕不同的時(shí)間，刻蝕液為硝酸和氫氟酸的混合溶液，其中硝酸的質(zhì)量百分比濃度為10%，氫氟酸的質(zhì)量百分比濃度為11.56%，刻蝕完成后將光學(xué)玻璃片超聲清洗80min，超聲頻率為45KHz，功率為600w，得到表面具有三維凹陷微結(jié)構(gòu)的光學(xué)玻璃片。

3 細(xì)胞富集實(shí)驗(yàn)

1） 將刻蝕15min有三維結(jié)構(gòu)修飾的刻蝕表面及光滑表面用紫外光照射3-5h，然后將體積為0.5mL （細(xì)胞數(shù)量大約為0.1× 105個(gè)）的乳腺癌細(xì)胞懸浮液均勻滴加到兩個(gè)矩形面上，再將玻璃片放入二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中孵化，孵化時(shí)間2～3h，乳腺癌細(xì)胞均勻附著在玻璃片表面上，通過注射泵使PBS（磷酸緩沖鹽溶液）水平地向小塊玻璃片的兩個(gè)相鄰矩形面以300 uL/min的流速同時(shí)進(jìn)行注射，時(shí)間為5min，倒置光學(xué)顯微鏡的10倍鏡視野固定。

2） 注射PBS（磷酸緩沖鹽溶液）前（即捕獲細(xì)胞前），乳腺癌細(xì)胞在光滑表面和刻蝕表面的數(shù)量分別為84和79個(gè)；注射PBS（磷酸緩沖鹽溶液）后（即捕獲細(xì)胞后），乳腺癌細(xì)胞在刻蝕表面和光滑表面上的數(shù)量分別為51和70個(gè)。由公式富集效率=沖洗細(xì)胞之后的殘留細(xì)胞數(shù)/沖洗細(xì)胞之前的細(xì)胞數(shù)可知，光滑表面和刻蝕表面的細(xì)胞效率分別為60.7%和88.6%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在經(jīng)過三維結(jié)構(gòu)修飾的表面對細(xì)胞的富集效率明顯優(yōu)于沒有經(jīng)過任何處理的表面的細(xì)胞富集效率。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)構(gòu)表明可以將此三維結(jié)構(gòu)用于構(gòu)造微流控芯片，用于提高微流控芯片對細(xì)胞的捕獲效率。

4 微流控芯片的制作

將兩片光學(xué)玻璃（75*25mm2）中其中一片按照設(shè)計(jì)要求雕刻出相應(yīng)的溝道，洗凈在烘箱中（80℃）干燥，將沒有溝道的部分進(jìn)行掩膜，防止在進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)修飾過程中被刻蝕損壞。對沒有掩膜區(qū)域進(jìn)行TiO2懸浮液噴涂，在室溫下等待噴涂涂層干燥之后，放入刻蝕液中進(jìn)行刻蝕，刻蝕15min之后，將兩片玻璃片中放入清洗液中超聲清洗10min之后，放入丙酮溶液中超聲清洗30min，洗凈之后，將兩片玻璃鍵合，然后進(jìn)行燒結(jié)，即得到有三維結(jié)構(gòu)修飾內(nèi)表面的微流控芯片。

5 總結(jié)

微流控芯片作為本世紀(jì)可以改變未來的科技領(lǐng)域之一，在過去的日子里，微流控器具憑借其一系列優(yōu)勢，在生命科學(xué)等領(lǐng)域已經(jīng)顯示了應(yīng)用前景。在設(shè)備小型化、高集成度和便攜化越來越高的情況下，另外一個(gè)與微流控技術(shù)相關(guān)卻一直未能克服的障礙，是“設(shè)備尺寸縮小而存在的效益遞減臨界點(diǎn)問題”系統(tǒng)縮小到微米甚至納米級的尺度范圍，與之結(jié)合的設(shè)備成為一個(gè)主要問題。加工手段需要變得更加方便容易，不需要太高的制造成本，是微流器件制造發(fā)展的方向。

參考文獻(xiàn)：

[1] 司桂英，李曉東. TiO_2懸浮液配制研磨工藝的優(yōu)化[J]. 聚酯工業(yè)，2017，30（2）：29-30.

[2] 劉侃，高易凡，張守坤，等. 一種三維微結(jié)構(gòu)的刻蝕方法及其應(yīng)用[P]. CN 107204288，2017-09-06.

[3] 何中媛. 微通道內(nèi)表面的微/納米結(jié)構(gòu)構(gòu)筑及功能化設(shè)計(jì)[D].東華大學(xué)，2011.

[4] 羅錫丹，賀建蕓，康維嘉，等. 微流控芯片光固化模塑成型的快捷加工技術(shù)[J]. 北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2017，44（5）：90-93.

[5] 朱哲欣，葉美英. 微流控芯片中TiO_2薄膜的低溫制備[J]. 硅酸鹽通報(bào)，2017，36（07）4：2397-2403.

[6] 司桂英，李曉東. TiO_2懸浮液配制研磨工藝的優(yōu)化[J]. 聚酯工業(yè)，2017，30（2）：29-30.

[7] 趙德. 基于微納結(jié)構(gòu)分離材料的微流控器件的構(gòu)建及其在蛋白質(zhì)分離中的應(yīng)用[D].東華大學(xué)，2016.

[8] 臧彬，于敏，方瑾. 應(yīng)用微流控芯片富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞的發(fā)展現(xiàn)狀及展望[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，2013，19（5）：458-463.endprint