鄭詠秋 張業(yè)昊 劉建勛 徐 立 李 磊 王益民 王 勇 王光蕊

(1 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京，100091; 2 西安步長(zhǎng)中醫(yī)心腦病醫(yī)院,西安,710082)

銀杏蜜環(huán)口服溶液的組為銀杏葉提取物和蜜環(huán)菌提取物。其主要作用為:擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管,增加冠脈血液流量或者腦部血液流量,同時(shí)改善局部微循環(huán)及細(xì)胞能量代謝,從而起到防止心腦血管的目的[1-2]。在前期本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)腦缺血/再灌注自噬信號(hào)通路調(diào)控的病理機(jī)制研究基礎(chǔ)上[3-4],本研究探討了銀杏蜜環(huán)口服溶液體外對(duì)缺氧缺糖再灌注誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞及專用培養(yǎng)液購(gòu)自Procell公司;SH-SY5Y細(xì)胞來自中科院上海細(xì)胞庫(kù),DEME培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.1.2 藥物 銀杏蜜環(huán)口服溶液,10 mL/支,批號(hào):160312;銀杏葉提取物溶液,10 mL/支,含3 mg銀杏葉提取物/ mL和含0.1 g蜜環(huán)粉/mL,含3 mg銀杏葉提取物/mL;蜜環(huán)菌溶液,10 mL/支,含0.1 g蜜環(huán)粉/ mL;以上均由邛崍?zhí)煦y制藥有限公司提供。研究試驗(yàn)中涉及銀杏蜜環(huán)口服溶液加樣高、中、低劑量分別為50、25、15 μL/mL,折算成含藥劑量分別為5.15 mg/mL、2.575 mg/mL、和1.545 mg/mL。同理,蜜環(huán)菌溶液,劑量2.5 mg/mL;銀杏葉提取物溶液,劑量0.075 mg/mL。

1.1.3 試劑與儀器 HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購(gòu)自YUARIO公司;兔抗磷酸化(GR95280-7)和非磷酸化eNOs多克隆抗體、兔抗Caspase3、Beclin-1、LC3I/II抗體購(gòu)自Abcam公司,兔抗GAPDH抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒,NEOBIOSCIENCE產(chǎn)品,IL-6 ELISA試劑盒,NEOBIOSCIENCE產(chǎn)品,TNFa ELISA試劑盒,MyBioSource產(chǎn)品。氟化聚偏乙烯(PVDF)微孔轉(zhuǎn)移膜購(gòu)自Millipore公司。超敏感底物發(fā)光試劑盒(SuperSignal West Femto kit),購(gòu)自Pierce公司。Annexin V/PI雙標(biāo)流式檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beyotime InC。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清,青、鏈霉素各100 μ/mL的Procell腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基,置37 ℃飽和濕度含5% CO2和95%空氣的恒溫箱中培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化傳代。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清,青、鏈霉素各100 μ/mL的高糖DMEM 培養(yǎng)基,置37 ℃飽和濕度含5% CO2和95%空氣的恒溫箱中培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化傳代。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞缺氧缺糖(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)再灌注損傷模型的建立 細(xì)胞以每孔1×106個(gè)的濃度接種于直徑35 mm小皿,貼壁24 h后,細(xì)胞以無糖Earles平衡鹽溶液[無糖OGD液(g/L):NaCl 6.8,KCl 0.4,CaCl2·2H2O 0.264,MgSO4·7H2O 0.2,NaH2PO4·2H2O 0.156,NaHCO32.2]洗滌2次,換成無糖OGD培養(yǎng)液,將細(xì)胞置于改良密閉OGD罐內(nèi),通以95%N2-5%CO2氣體,通氣30 min后,置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞6 h氧糖剝離后,更換成無血清DMEM培養(yǎng)基再灌注。正常對(duì)照采用有糖OGD液(g/L):NaCl 6.8,KCl 0.4,CaCl2·2H2O 0.264,MgSO4·7H2O 0.2,NaH2PO4·2H2O 0.156,NaHCO32.2,葡萄糖1.0培養(yǎng)。SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)4 h氧糖剝離后,更換成無血清DMEM培養(yǎng)基再灌注。正常對(duì)照采用有糖OGD液(g/L):NaCl 6.8,KCl 0.4,CaCl2·2H2O 0.264,MgSO4·7H2O 0.2,NaH2PO4·2H2O 0.156,NaHCO32.2,葡萄糖1.0培養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為正常細(xì)胞對(duì)照組、模型組、各給藥組。1)正常對(duì)照組:實(shí)驗(yàn)時(shí)吸出正常培養(yǎng)基,加入正常無血清培養(yǎng)基。2)模型組:吸出正常培養(yǎng)基,加入無血清培養(yǎng)基。3)給藥組(不同劑量):模型組分別加入終濃度為5.15 mg/mL(100 μL銀杏蜜環(huán)口服溶液+1.9 mL無血清培養(yǎng)基)、2.575 mg/mL(50 μL銀杏蜜環(huán)口服溶液+1.95 mL無血清培養(yǎng)基)和1.545 mg/mL(25 μL銀杏蜜環(huán)口服溶液+1.975 mL無血清培養(yǎng)基)的銀杏蜜環(huán)口服溶液、0.075 mg/mL的銀杏提取物(50 μL銀杏提取物溶液+1.95 mL無血清培養(yǎng)基)和2.5 mg/mL的蜜環(huán)提取物(50 μL蜜環(huán)菌溶液+1.95 mL無血清培養(yǎng)基)。6 h糖氧剝離后加入藥品作用,并立即復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)并在24 h后收集活細(xì)胞進(jìn)行凋亡的含量測(cè)定。

1.2.4 ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液IL-1β、TNF-α和IL-6的含量 本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗IL-1β、TNF-α和IL-6單抗包被于酶標(biāo)板上,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的IL-1β、TNF-α和IL-6與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗體,形成免疫復(fù)合物連接在板上,辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合,加入酶底物TMB,出現(xiàn)藍(lán)色,加終止液硫酸,顏色變黃,在450 nm處測(cè)OD值,細(xì)胞因子濃度與OD值成正比,可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中細(xì)胞因子濃度。

1.2.5 Western-blot法檢測(cè)eNOS磷酸化和自噬蛋白表達(dá) 采用蛋白裂解液提取胞質(zhì)蛋白組織于4 ℃,3 000 r/min離心4 min,收集上清,進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。BCA法測(cè)定蛋白含量并定濃度至0.5 mg protein/mL,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),采用相關(guān)抗體進(jìn)行磷酸化和非磷酸化相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(Enhanced Chemiluminescence,ECL)顯色。底片曝光。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞,每樣品配制成5×105/mL懸液,離心去上清,加入195 μL AnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞,加入10 μL PI染色液和5 μL FITC-conjugated Annexin-V進(jìn)行雙重染色20 min。然后在Epic XL流式細(xì)胞儀上在488 nm處檢測(cè),應(yīng)用Expo32軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品1 000、500、250、100、50、25 pg/mL之OD值在半對(duì)數(shù)紙上作圖,畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將濃度作為X軸(對(duì)數(shù)軸),OD值作為Y軸(線性軸)。曲線應(yīng)為一光滑曲線。根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)細(xì)胞因子含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,數(shù)據(jù)組件比較采用方差檢驗(yàn),Western Blot圖像分析結(jié)果采用SPSS軟件(Version 11.0)進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上清液炎性反應(yīng)因子含量的影響 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在6 h的缺糖缺氧損傷和24 h的再灌注后與對(duì)照組比較,其上清液IL-1β、TNF-α和IL-6含量明顯升高(P<0.05);分別給予5.15 mg/mL、2.575 mg/mL、和1.545 mg/mL的銀杏蜜環(huán)口服溶液、0.075 mg/mL的銀杏提取物和的2.5 mg/mL蜜環(huán)提取物后,發(fā)現(xiàn)銀杏蜜環(huán)口服溶液高、中、低3個(gè)劑量組、銀杏提取物0.075 mg/mL和蜜環(huán)提取物2.5 mg/mL均可抑制上清液TNF-α、IL-1β和IL-6含量,其中銀杏蜜環(huán)口服溶液中劑量(2.575 mg/mL)對(duì)IL-1β和IL-6含量的抑制明顯優(yōu)于銀杏提取物(0.075 mg/mL)和蜜環(huán)提取物(2.5 mg/mL)。比較之下,銀杏蜜環(huán)口服溶液大、低劑量組(5.15 mg/mL、1.545 mg/mL)作用較弱,所以在接下來的試驗(yàn)中,將銀杏蜜環(huán)劑量定為2.575 mg/mL、1.545 mg/mL 2個(gè)劑量。見表1。

2.2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬信號(hào)通路活化的影響 6 h的缺糖缺氧損傷和24 h的再灌注可引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡蛋白Caspase3和自噬蛋白Beclin-1表達(dá)升高,銀杏蜜環(huán)口服溶液(1.545、2.575 mg/mL)可明顯抑制Caspase3和Beclin-1表達(dá),同時(shí)銀杏提取物也可抑制Beclin-1表達(dá)。模型組eNOS磷酸化水平降低,LC3II/LC3I水平升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中銀杏蜜環(huán)口服溶液(1.545、2.575 mg/mL)和其有效組分銀杏提取物、蜜環(huán)提取物均可明顯抑制LC3II/LC3I,銀杏蜜環(huán)口服溶液(2.575 mg/mL)還可有效提升eNOS磷酸化水平?？梢娿y杏蜜環(huán)口服溶液療效要優(yōu)于其有效組分銀杏提取物、蜜環(huán)提取物。見圖1～5。

2.3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 模型組分別加入終濃度為25 μL/mL、15 μL/mL的銀杏蜜環(huán)口服溶液、25 μL/mL的銀杏提取物和25 μL/mL的蜜環(huán)提取物。4 h糖氧剝離后加入藥品作用,并立即復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)并在10 h后收集活細(xì)胞進(jìn)行凋亡的含量測(cè)定。

注：與假手術(shù)組(正常對(duì)照組)比較,**P<0.01;與模型組比較,△P<0.05,△△P<0.01;與銀杏提取物比較,▲▲P<0.01;與蜜環(huán)提取物比較,□□P<0.01

根據(jù)PI/Annexin V雙染色采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率,結(jié)果見以下圖表所示。從圖中可以看出,當(dāng)采用缺氧缺糖處理細(xì)胞后,細(xì)胞的凋亡率明顯提高(Annexin V+/PI-細(xì)胞),其差距具有顯著性意義,這說明缺氧缺糖能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡過程。25 μL/mL、15 μL/mL的銀杏蜜環(huán)口服溶液、25 μL/mL的銀杏提取物和25 μL/mL的蜜環(huán)提取物可有效減輕缺氧缺糖引發(fā)的細(xì)胞凋亡,各給藥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2、圖6。

圖1 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo) 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)的影響

圖2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo)腦 微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬蛋白LC3II/LC3I的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

圖3 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo) 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOs磷酸化的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

圖4 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo) 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬蛋白Beclin-1的影響

注：與假手術(shù)組(正常對(duì)照組)比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表2 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖 誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡后各亞群 細(xì)胞數(shù)的影響

注:與正常對(duì)照組比較,**P<0.01;與模型組比較,△△P<0.01

圖5 銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖誘導(dǎo) 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3的影響

注：與假手術(shù)組(正常對(duì)照組)比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

圖6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定PI/Annexin V每組典型圖片

3 討論

腦缺血引起的神經(jīng)元死亡形式主要包括自噬、凋亡和壞死。自噬是溶酶體對(duì)細(xì)胞內(nèi)的部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等進(jìn)行的一系列降解過程的統(tǒng)稱。適度的自噬是細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持的重要途徑[5]。另一方面,自噬可引起Ⅱ型程序性死亡(Programmed Cell Death Ⅱ,PCDⅡ),又稱自噬性細(xì)胞死亡(Autophagic Cell Death,ACD),為一種半胱天冬酶(caspase)相關(guān)性死亡[6]。本研究深入評(píng)價(jià)了銀杏蜜環(huán)口服溶液對(duì)缺氧缺糖再灌注誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOs介導(dǎo)的Beclin-1依賴的自噬通路的影響。腦損傷后產(chǎn)生的炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6在神經(jīng)元壞死、炎性脹亡和接下來的繼發(fā)性損傷中發(fā)揮重要作用,也和細(xì)胞自噬過程密不可分。缺血缺氧再灌注后神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞均可產(chǎn)生炎性因子。本研究采用缺氧缺糖再灌注誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建糖氧剝離+復(fù)糖復(fù)氧模型,同時(shí)給予不同濃度的銀杏蜜環(huán)口服溶液及有效組分進(jìn)行干預(yù),并且通過觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度和自噬通路的活化,來探討銀杏蜜環(huán)口服溶液的腦保護(hù)機(jī)制。結(jié)果表明,銀杏蜜環(huán)口服溶液高、中、低3個(gè)劑量組均可抑制上清液TNF-α、IL-1β和IL-6含量,可明顯抑制Caspase3和Beclin-1表達(dá),其中對(duì)L-1β和IL-6的作用明顯優(yōu)于銀杏葉提取物和天麻蜜環(huán)菌。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)銀杏蜜環(huán)口服溶液可通過促進(jìn)一氧化氮合酶eNOs的磷酸化來抑制缺糖缺氧再灌引發(fā)的細(xì)胞凋亡和自噬。同時(shí)其中銀杏蜜環(huán)口服溶液中劑量(2.575 mg/mL)對(duì)IL-1β和IL-6含量的抑制明顯優(yōu)于銀杏提取物(0.075 mg/mL)和蜜環(huán)提取物(2.5 mg/mL)。

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[2]韓永鵬,徐佳,朱樹建.冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病心絞痛銀杏蜜環(huán)口服溶液治療分析[J].現(xiàn)代養(yǎng)生(下半月版),2017,32(7):69.

[3]鄭詠秋,劉建勛,徐立,等.維腦康及銀杏總內(nèi)酯對(duì)局灶性腦缺血再灌注自噬和神經(jīng)發(fā)生作用研究[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(13):2182-2186.

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