彭修娟 杜志德 頓寶生 楊新杰

(1 陜西國際商貿(mào)學(xué)院，咸陽，712046； 2 陜西中醫(yī)學(xué)院，咸陽，712046)

中風(fēng)又名卒中,其基本病機為陰陽失調(diào)、氣血逆亂、上犯于腦,導(dǎo)致腦脈痹阻或血溢腦脈之外,臨床以卒然昏仆、不省人事、半身不遂、口舌歪斜、語言不利、偏身麻木為主癥的一種疾病[1]。因本病起病急劇,變化迅速,與自然界善行而數(shù)變之風(fēng)邪特性相似,故古人以此類比,名為中風(fēng)[2]。中風(fēng)是中醫(yī)學(xué)中的4大頑疾之一,具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致殘率高、病死率高的特點,嚴(yán)重危害人民健康的疾病[3]。中風(fēng)初發(fā)時以風(fēng)證為主；發(fā)病1～2周時,以痰濕證、血瘀證為多；恢復(fù)期以血瘀證、氣虛證為多[4]。現(xiàn)代血液流變學(xué)研究表明,中風(fēng)患者血液存在著“濃”(紅細(xì)胞比容增高)、“黏”(全血黏度比、血漿黏度比和纖維蛋白原增高)、“聚”(紅細(xì)胞時間性泳時間長)的情況[5]。故益氣活血法為中風(fēng)、特別是中風(fēng)恢復(fù)期的重要治療法則。

黃七膠囊是在黃七湯的基礎(chǔ)上研制而成，由黃芪、土鱉蟲、三七、葛根四味藥材組成，具有益氣活血，化瘀通絡(luò)之功效。用于氣虛血瘀，脈絡(luò)瘀阻所致的中風(fēng)恢復(fù)期，對半身不遂，肢體麻木，口眼歪斜，言語不清或不語，感覺減退或消失治療效果良好[6]。方中佐藥三七具有散瘀止血、消腫止痛之功效，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》謂之：“化瘀血而不傷新血，允為理血妙品”[7]。現(xiàn)代研究證明，三七具有明顯的腦組織保護(hù)作用且能改善腦部血液循環(huán)[8-9]；三七所含的人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1等有效成分能明顯擴張腦血管、降低腦血管阻力、增加腦血管血流量，對頸部動脈亦有擴張作用，對顱腦損傷有保護(hù)作用[10-11]；可改善腦缺血再灌注損傷后腦組織能量代謝,促進(jìn)缺血腦組織對能量物質(zhì)的利用[12]；能減輕缺血腦組織的炎性反應(yīng)，保護(hù)缺血腦組織[13]；能保護(hù)神經(jīng)元，降低腦缺血后梗死體積及水腫體積[14]；能改善血管內(nèi)皮功能，降低血液黏度，抑制血小板活化和聚集從而具有抗血栓形成的作用[15]。在新藥研制過程中，對黃七膠囊中三七的3種功效成分—人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1進(jìn)行方法學(xué)研究，建立科學(xué)合理、專屬性強的高效液相含量測定方法。所建方法專屬性強、重現(xiàn)性好、樣品檢測結(jié)果穩(wěn)定，可用于本制劑的質(zhì)量控制。此外，按不同的比例的乙腈-水進(jìn)行梯度洗脫，以峰面積為篩選指標(biāo)，優(yōu)選出3種成分的最佳流動相比例完全相同，即：0～30 min，乙腈19→40，水81→60。該流動相梯度洗脫比例同《中華人民共和國藥典》2010年版一部[16]比較，提高了峰面積和理論塔板數(shù)，并節(jié)省了時間。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 P3000型高效液相色譜儀，P3000型紫外檢測器；CXTH-3000色譜工作站，7725i進(jìn)樣器；UV-755B紫外可見分光光度計。

1.2 試藥 10批樣品由楊凌無為制藥集團(tuán)有限公司自制；人參皂苷Rg1對照品(批號：110703-200726)、人參皂苷Rb1對照品(批號：110704-200420)、三七皂苷R1對照品(批號：110745-200617)，皆為供含量測定用，由中國藥品生物制品檢定所提供。3批研究用中試樣品由該公司膠囊劑車間生產(chǎn)；乙腈和甲醇皆為色譜純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

2.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷合硅膠為填充劑，柱壓：11.0 MPa，流速：1.0 mL/min；柱溫：45 ℃。理論板數(shù)按三七皂苷R1峰計算應(yīng)不低于4 000。拖尾因子為1.03。

2.1.2 流動相的選擇比例 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫，按正文方法用對照品溶液作圖，以峰面積為篩選指標(biāo)，找出最佳流動相比例。三七皂苷R1對照品、人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品流動相結(jié)果見表2～4。

表1 流動相梯度設(shè)置

表2 三七皂苷R1對照品流動相選擇結(jié)果

注：—為無數(shù)據(jù)

表3 人參皂苷Rg1對照品流動相選擇結(jié)果

注：—為無數(shù)據(jù)

表4 人參皂苷Rb1對照品流動相選擇結(jié)果

注：—為無數(shù)據(jù)

從表1可以看出，比例5為最佳流動相洗脫比例，即：時間0～30 min，流動相A19%→40%，流動相B81%→60%。

該洗脫比例同《中華人民共和國藥典》2010年版一部三七含量測定項下的流動相梯度洗脫比例相比較，提高了峰面積和理論板數(shù)，并節(jié)省了檢驗時間。在此條件下，三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Rb1的保留時間分別為：12.865 min、14.647 min、26.714 min。對照品、中試樣品、三七的陰性對照色譜圖分別見圖1～3。

圖1 三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Rb1色譜圖

2.2 提取方法

2.2.1 提取溶劑的選擇 人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1在甲醇、乙醇和水中均有較好的溶解度，用水、50%甲醇、100%甲醇、50%乙醇和100%乙醇提取并進(jìn)行比較，選擇出最佳的提取溶劑。取樣品(批號：20140406)5份(約1.0 g)精密稱定，分別精密加入上述5種溶劑50 mL，稱定質(zhì)量，放置過夜，置80 ℃水浴上保持微沸2 h、放冷，再稱定質(zhì)量，分別用5種溶劑補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，結(jié)果表明，用甲醇作為提取溶劑3種皂苷提取率最高，雜質(zhì)干擾最少，故選擇甲醇作為提取溶劑。

圖2 中試樣品色譜圖

圖3 三七的陰性對照色譜圖

2.2.2 提取時間的確定 分別稱取樣品約1.0 g(批號20140406)5份，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，放置過夜，置80 ℃水浴上保持微沸0.5、1、2、3、4 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。分別精密吸取對照品與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，結(jié)果表明，保持微沸3 h，即可使樣品中3種皂苷提取率最高，故保持微沸時間確定為3 h。

2.3 測定方法的選擇

2.3.1 最大吸收波長的選擇 分別吸取人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1對照品溶液(濃度分別為：0.424 8 mg/mL、0.426 9 mg/mL、0.101 0 mg/mL)在200～250 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明，3種皂苷在203 nm處皆有最大吸收。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1對照品溶液(濃度分別為：0.424 8 mg/mL、0.426 9 mg/mL、0.101 0 mg/mL)2、4、8、12、18 μL，HPLC測定峰面積，三者的回歸方程分別為Y=377341X+31058.2(r=0.999 9，n=6)、Y=285 201X+461 3.9(r=0.999 9，n=6)、Y=398 066X-159 9.4(r=0.999 9，n=6)。

研究結(jié)果表明，人參皂苷Rg1進(jìn)樣量在0.849 6～7.646 4 μg，Rb1在0.853 8～8.853 8 μg，三七皂苷R1在0.202 0～2.020 0 μg范圍內(nèi)皆與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取本品(批號20140406)精密稱定，按優(yōu)選的提取方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)行測定，即得。結(jié)果上述3種皂苷的RSD分別為1.51%、1.21%、1.30%，表明本品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 精密度試驗 取人參皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1對照品溶液，重復(fù)測定5次，記錄峰面積，結(jié)果上述3種皂苷的RSD分別為0.93%、0.69%、0.42%，結(jié)果表明本方法精密度較好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取批號為20140406的樣品6份，按優(yōu)選的提取方法制備供試品溶液，測定含量，結(jié)果上述3種皂苷的RSD分別為1.89%、1.59%、1.37%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗 取已知含量的樣品(批號20140406，人參皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1的含量分別為5.490 7 mg/粒、4.342 8 mg/粒、1.057 7 mg/粒)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入人參皂苷Rg1、Rb1以及三七皂苷R1對照品溶液(濃度分別為0.335 8 mg/mL、Rb10.329 3 mg/mL、0.168 1 mg/mL)25 mL，再精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，放置過夜，置80 ℃水浴上保持微沸3 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，依法測定，結(jié)果三者的平均回收率分別為99.60%(RSD=1.53%)、100.10%(RSD=1.68%)、99.04%(RSD=1.40%)。結(jié)果表明，三者的回收率均良好。

2.4 樣品測定 按處方量的1/10，分別制備7批樣品，連同成型工藝研究試驗的3批樣品，依據(jù)正文中含量測定方法，進(jìn)行含量測定。見表5。經(jīng)對10批樣品中人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的總量的測定，平均值為11.04 mg/粒，考慮到藥材來源及大工業(yè)生產(chǎn)等因素，暫定每粒含三七以人參皂苷Rg1(C42H72O14)、人參皂苷Rb1(C54H92O23)和三七皂苷R1(C47H80O18)三者的總量計，不得少于8.8 mg。

表5 樣品中人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷 R1總量測定結(jié)果

2.5 驗證實驗 采用云南文山產(chǎn)的三七投料，制得的3批中試樣品，批號：20140602、20140605、20140608，對三七所含人參皂苷Rg1、Rb1及三七皂苷R1的總量進(jìn)行了測定。另外在該處方中取掉三七，按正文生產(chǎn)工藝投料制作，制成陰性對照品，分別進(jìn)行含量測定。見表6。

表6 中試樣品含量測定結(jié)果

以上3批中試樣品含量均符合規(guī)定，平均測得值為11.0 mg/粒，含量測定成分的轉(zhuǎn)移率為80.0%，證明該標(biāo)準(zhǔn)所制定的三七含量限度可行，陰性對照品在相應(yīng)部位未出峰，證明處方中其他藥材對本含量測定無干擾。

3 討論

在流動相選擇比例試驗中，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，這和中華人民共和國藥典2010年版一部三七含量測定項下一致[5]。按不同的A與B的比例進(jìn)行梯度洗脫，以峰面積為篩選指標(biāo)，優(yōu)選出的流動相梯度洗脫比例同中華人民共和國藥典比較，提高了峰面積和理論塔板數(shù)，并節(jié)省了時間。經(jīng)分別篩選，3種成分的最佳流動相比例完全相同。

雖然提取溶劑與中華人民共和國藥典相同皆用甲醇，但提取時間由中華人民共和國藥典的2 h優(yōu)選成了3 h，在這樣的時間條件下，3種皂苷的提取率皆最高。

在本實驗條件下，穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、線性關(guān)系良好。3種功效成分的回收率皆在99%以上，經(jīng)10批樣品及3批中試樣品的驗證實驗，證明該標(biāo)準(zhǔn)所制定的三七含量限度可行，陰性對照品在相應(yīng)部位未出峰，證明處方中其他藥材對本含量測定無干擾。

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