岳路路 高 敏 張秋紅 閆 濱

(1 山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南，250355； 2 濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，濟(jì)南，250102)

2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定海藻為馬尾藻科植物羊棲菜Sargassum fusiforme(Harv.)Setch.或海蒿子Sargassum pallidum(Turn.)C.Ag.的干燥藻體。具有利水消腫，消痰軟堅(jiān)散結(jié)的功能。主治痰飲水腫，瘰疬，睪丸腫痛，癭瘤。目前，已有許多含海藻成分的中成藥，例如，消癭丸、心通口服液、乳核散結(jié)片等等。海藻中含有大量的碳水化合物，其中最重要的是多糖，通常占海藻干物質(zhì)的50%以上，具有良好的抗腫瘤、抗凝血、抗病毒、降血脂等眾多生物活性[1]。羊棲菜作為中藥海藻的重要組成部分，已經(jīng)有文獻(xiàn)研究證實(shí)其多糖具有抗HSV-1及CVB3的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取、分離、純化羊棲菜，對(duì)其提取物進(jìn)行了體外抗7種第3類(lèi)病原體病毒的篩選，效果顯著。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 MA104(為RSV、HSV-1、CVB2敏感細(xì)胞)；Hep2(為CVB3、CVB5敏感細(xì)胞)；RD(為EV71、CVA16敏感細(xì)胞)；均由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物室提供。

病毒株RSV(long株，2000年10月引自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毒種室)；HSV-1(F株，1996年引自山東醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室)；EV71(分離自濟(jì)南市傳染病醫(yī)院手足口病患者，經(jīng)全序列測(cè)定證實(shí)為EV71)；CVB3(Nancy株，2010年引自山東省防疫站流感病毒室)；均由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物室提供。

1.1.2 藥物 羊棲菜采集自煙臺(tái)近海，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院閆濱副教授鑒定為羊棲菜。新鮮海藻低溫烘干之后研磨成細(xì)粉，以海藻粉末：蒸餾水為1∶30的比例，水煎煮4.5～6 h，中間換液共提取3次。合并濾液，旋蒸濃縮為原體積的1/4后，加入5%三氯乙酸，5 000 r/min離心20 min以除去粗提溶液中的蛋白質(zhì)，所得溶液裝入透析袋中透析(3 d左右)，將溶液冷凍過(guò)夜，加入4倍體積的95%乙醇沉淀多糖，離心取沉淀，真空干燥即可得到羊棲菜粗提粉末[2-4]。再經(jīng)Smartrose CL-6B凝膠過(guò)濾色譜柱過(guò)濾進(jìn)行純化。采用蒽酮硫酸法測(cè)定海藻提取物多糖含量，以0.1 g/L的葡萄糖溶液配制系列濃度溶液，紫外分光光度計(jì)在625 nm處測(cè)定吸光度(A值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算海藻粉末的含糖量。以葡萄糖計(jì)多糖含量80.41%。

稱(chēng)取適量海藻粉末溶解于PBS中，用0.22 μm的濾器過(guò)濾除菌，放置于-20 ℃冰箱備用。

陽(yáng)性對(duì)照藥為利巴韋林注射液，50 g/L，產(chǎn)品批號(hào)1501166141，辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，作為廣譜抗病毒藥物，是本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥。用PBS將其稀釋到20 μg/mL的濃度，用0.22 μm的濾器過(guò)濾除菌，放置于-20 ℃冰箱備用。

1.1.3 試劑與儀器 細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清及100 μg/mL青霉素和鏈霉素的GIBCO生產(chǎn)的1640)；細(xì)胞維持液(含2%胎牛血清及100 μg/mL青霉素和鏈霉素的GIBCO生產(chǎn)的1640)；細(xì)胞消化液(稱(chēng)取Diffico公司胰酶2.5 g溶解于1000 mL PBS制成0.25%胰酶)。細(xì)胞消化液放至-20 ℃冷凍備用，其他置于4 ℃冷藏備用。

BC-J160S型水套紅外二氧化碳培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon ECLIPSE Ti系列)；HFsafe1200/C型生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 細(xì)胞生物學(xué)方法：按照常規(guī)方法復(fù)蘇細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，待細(xì)胞形態(tài)規(guī)范、長(zhǎng)勢(shì)良好之時(shí)分別以105/mL細(xì)胞濃度接種于96孔板，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，24 h后待細(xì)胞長(zhǎng)成單層用于下一步實(shí)驗(yàn)。

病毒生物學(xué)方法：病毒活化，取保存的200 μL毒種分別接種在已長(zhǎng)成單層的相關(guān)細(xì)胞上，加入2%細(xì)胞維持液，在35 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。顯微鏡下持續(xù)觀察，細(xì)胞病變達(dá)到90%時(shí)收集。將收獲的病毒反復(fù)凍融3次，吹打，1 000 r/min離心5 min，上清液定量分裝，-40 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩２《径玖y(cè)定，用細(xì)胞維持液取病毒原液做10倍比系列稀釋?zhuān)v向重復(fù)3孔，橫向依次接種100 μL病毒于已長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板上，設(shè)置正常對(duì)照，35 ℃、5%CO2培養(yǎng)，48 h后觀察細(xì)胞出現(xiàn)病變情況[5-8]。用MTT法染色，測(cè)定490 nm處的A值，然后用Reed-Muench兩氏法計(jì)算各病毒的半數(shù)細(xì)胞感染量TCID50。

1.2.2 給藥方法 藥物細(xì)胞毒性測(cè)定：將受試藥物用細(xì)胞維持液進(jìn)行2倍比稀釋12種濃度，分別接種在長(zhǎng)成單層RD、MA104、Hep-2細(xì)胞的96孔板上，每個(gè)濃度重復(fù)3孔，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，持續(xù)觀察藥物毒性，顯微鏡下觀察其CPE。

體外藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)：用細(xì)胞維持液將藥物從第1孔開(kāi)始2倍比稀釋12個(gè)濃度，以每50 μL的濃度加在長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板上，設(shè)細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照以及陽(yáng)性藥對(duì)照，藥物的每個(gè)稀釋度設(shè)重復(fù)3孔。除細(xì)胞對(duì)照外，各孔加50 μL 100TCID50毒力的病毒。35 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，顯微鏡下持續(xù)觀察。病毒對(duì)照孔的CPE達(dá)到90%后終止培養(yǎng)[9-12]。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 藥物細(xì)胞毒性測(cè)定：MTT法染色，酶標(biāo)儀測(cè)定A值，計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(toxic concentration 50%，TC50)。

體外藥物抗病毒實(shí)驗(yàn)：正常細(xì)胞與相應(yīng)發(fā)生病變細(xì)胞圖見(jiàn)圖1。MTT法染色測(cè)定A值，根據(jù)公式計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)[13]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)所得檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果計(jì)算藥物抑毒指數(shù)(TI)，TI=TC50/EC50，TI大于4者即為有效[14-16]。

2 結(jié)果

正常狀態(tài)的MA104、RD以及Hep-2細(xì)胞形態(tài)，以分別感染病毒后的細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖1。正常細(xì)胞感染不同的病毒后在細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)功能等會(huì)發(fā)生各自特異性的病變，顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，細(xì)胞會(huì)變圓、變小，細(xì)胞皺縮，甚至破裂，折光性變強(qiáng)，或者發(fā)生細(xì)胞融合，等等。但是在加入羊棲菜提取物之后細(xì)胞病變明顯減弱，甚至未顯現(xiàn)細(xì)胞病變，羊棲菜提取物保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染的效果顯著，抑毒指數(shù)極高。

圖1 正常細(xì)胞以及病變細(xì)胞鏡下觀(×200)

本實(shí)驗(yàn)體外抗病毒藥物羊棲菜提取物對(duì)RSV、HSV-1、EV71、CVA16、CVB2、CVB3、CVB5等7種病毒的抗病毒效應(yīng)分別做96孔板實(shí)驗(yàn)，為排除羊棲菜提取物對(duì)病毒的抑制作用與羊棲菜提取物引起的細(xì)胞毒性無(wú)關(guān)，檢測(cè)了其對(duì)RD、MA104、Hep-2細(xì)胞毒性作用，并且考慮到減小對(duì)細(xì)胞觀察的影響，得出對(duì)RD細(xì)胞TC50=6.11 g/L，對(duì)MA104細(xì)胞TC50=3.15 g/L，對(duì)Hep-2細(xì)胞TC50=6.33 g/L，利巴韋林低于100.00 μg/mL的濃度對(duì)各細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響。

與病毒對(duì)照組、利巴韋林對(duì)照(EC50=20.00 μg/mL)組比較，羊棲菜提取物對(duì)各病毒的藥物半數(shù)有效濃度見(jiàn)表1。

表1 羊棲菜提取物藥物半數(shù)有效濃度

根據(jù)抑毒指數(shù)TI=TC50/EC50公式，得到羊棲菜和利巴韋林對(duì)各病毒的TI，可見(jiàn)羊棲菜提取物對(duì)上述7種病毒的抑制能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于廣譜抗病毒藥物利巴韋林，羊棲菜提取物是優(yōu)質(zhì)高效的抗病毒藥物，尤以對(duì)EV71的抑制效果最為明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 羊棲菜提取物和利巴韋林對(duì)各病毒的TI折線圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了羊棲菜提取物對(duì)呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒系列A16、B2、B3、B5等7種病毒的體外細(xì)胞水平的抑制實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)研究表明羊棲菜提取物具有非常顯著的體外抗病毒效果。由于其抗病毒性質(zhì)的普遍，而且研究所用為第三類(lèi)病原體病毒，我們可以大膽推測(cè)羊棲菜對(duì)第三類(lèi)危害程度病毒(國(guó)家根據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對(duì)個(gè)體或者群體的危害程度，將病原微生物分為四類(lèi)。第三類(lèi)病原微生物，是指能夠引起人類(lèi)或者動(dòng)物疾病，但一般情況下對(duì)人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害的微生物)具有廣譜抑制作用，此推斷有待進(jìn)一步抗病毒篩選研究和體外藥理作用研究證實(shí)。其抗病毒作用的機(jī)理也是將要進(jìn)一步研究的方向。

海藻是生長(zhǎng)于海洋中的低等隱花植物，種類(lèi)多，

分布廣。在魚(yú)、蝦、貝、藻四大類(lèi)海洋生物中，僅海藻是海洋中的植物，具有地球最大的生物蘊(yùn)藏量，極具開(kāi)發(fā)潛力。而羊棲菜作為中藥用的海藻具有其中醫(yī)學(xué)價(jià)值和保健價(jià)值，近年來(lái)其抗病毒作用愈來(lái)愈受到關(guān)注，對(duì)其抗病毒作用的研究也是對(duì)傳統(tǒng)中藥功能主治的拓展和延伸，對(duì)中醫(yī)學(xué)和中藥學(xué)的繼承與發(fā)展具有重要的意義。

[1]岑穎洲,王凌云,馬夏軍,等.羊棲菜多糖體外抗病毒作用研究[J].中國(guó)病理生理雜志,2004,20(5):765-768.

[2]岑穎洲,馬夏軍,王凌云,等.羊棲菜多糖提取工藝及其單糖組成研究[J].藥物生物技術(shù),2004,11(6):373-375.

[3]楊銘,郎朗,季宇彬.海藻羊棲菜藥用功能研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2013,26(4):450-451.

[4]謝何杰,葉慧嫻,沈婷,等.羊棲菜化學(xué)成分和藥理活性的研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(4):487-491.

[5]陳恬,賈文祥,楊發(fā)龍,等.藏藥紫金標(biāo)抗HSV-1的作用機(jī)理研究[J].中國(guó)中藥雜志,2004,29(9):882-886.

[6]何超蔓,聞良珍.3種中藥體外抗巨細(xì)胞病毒效應(yīng)的比較[J].中國(guó)中藥雜志,2004,29(5):452-455.

[7]方建國(guó)，胡婭，湯杰，等.大青葉抗單純皰疹病毒Ⅰ型的活性研究[J].中國(guó)中藥雜志,2005,30(17):1343-1346.

[8]田蕾，李曉艷，徐云霞，等.三白草抗單純皰疹病毒作用及機(jī)制[J].中國(guó)中藥雜志,2012,37(11):1642-1645.

[9]王志潔，楊占秋，黃鐵牛.桑寄生乙醇提取物抗柯薩奇病毒B3的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中藥雜志,2000,25(11):685.

[10]王意忠,崔曉蘭,高英杰,等.梔子提取物抗病毒試驗(yàn)研究[J].中國(guó)中藥雜志,2006,31(14):1176-1178.

[11]黃筱鈞,張朝貴.車(chē)前草對(duì)呼吸道合胞病毒體外抑制作用的研究[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版,2015,32(2):1-3.

[12]張莉,李園園,史梅等.虎杖苷與白藜蘆醇體外抗腸道病毒71型的初步研究[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2014,32(10):779-783.

[13]馬書(shū)太,李詩(shī)標(biāo).紫萁貫眾提取物體外抗病毒實(shí)驗(yàn)研究[J].山東中醫(yī)雜志,2014,33(8):663-664.

[14]曹澤彧，謝雪，?，摚?熱毒寧注射液組分抗CoxA16和EV71病毒活性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2015,21(14):106-110.2015,21(14):106-110.

[15]崔清華，何軍，呂旭瀟，等.小兒雙金清熱口服液體外抗病毒作用研究[J].藥學(xué)研究,2015,34(11):631-633,669.

[16]艾碧琛,賀又舜,趙國(guó)榮等.甘露消毒丹及其拆方體外抗腸道病毒71型作用[J].中醫(yī)雜志,2014,55(8):695-697.